スーパースピードコンジェニック法の確立

超高速同类方法的建立

• 批准号: 14780622
• 负责人: 尾畑 やよい
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture (2003)Gunma University (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780622/
• 关键词: 卵母細胞; DNAメチル化; 核移植; 胚発生; ゲノミックインプリンティング; インプリンティング; メチル化; 卵子形成; 体外培養

雌性生殖細胞が卵子として機能するためには、核の成熟(減数分裂を完了する能力;出生前後で獲得)、ゲノムの成熟(卵子特異的なDNAメチル化型の確立;いつか?)および細胞質の成熟(着床前発生に必要なmRNAや蛋白質などの蓄積;生後4週くらいの十分成長した卵母細胞で完了)を必要とする。申請者らのこれまでの研究で、16日齢マウスの成長期卵母細胞の核を十分成長した卵母細胞の細胞質に核移植すると、個体の性成熟に先立って次の世代を誕生させることがわかっている(5週間短縮される)。そこで申請者らは卵子特異的なDNAメチル化が卵子形成過程でいつどのように確立するのかを明らかにし、核移植技術を駆使することにより、より積極的な卵子の成熟誘導を試みた。種々の成長ステージの卵母細胞(40〜44,45〜49,50〜54,55〜59,60〜64,65〜69,70〜μm)を生後10、15および20日齢のマウスより採取し、Snrpn、Igf2r、Lit1、Zac1およびPeg1遺伝子のDNAメチル化解析を実施した。その結果、Igf2r、Lit1およびZac1遺伝子は60μm以上で、SnrpnおよびPeg1遺伝子は65μm以上で卵子特異的な高メチル化を確立していることが明らかとなり、遺伝子ごとにメチル化確立時期が異なることが示された。また、卵子特異的なDNAメチル化はドナーマウスの加齢に依存せず、卵子のサイズに依存して完了することが判明した。ついで、10日齢マウスより採取した50〜59μmの成長途上の卵母細胞核を十分成長した卵子の細胞質に核移植し、減数分裂・体外受精後の発生能を解析した。その結果、成長期卵母細胞より再構築された受精卵は産仔への発生能(8%)を有することが明らかとなった。以上の結果から10日齢マウスの卵母細胞をコンジェニックマウスの作出に応用すると、29日間(卵子特異的なDNAメチル化を確立するための10日間+妊娠期間の19日間)で次世代を誕生させることが可能になり、遺伝子改変マウスのコンジェニック化促進に貢献できる技術が確立された(投稿準備中)。

Female germ cells: egg function; nuclear maturation (meiosis completion ability; acquired before and after birth); maturation (ovum-specific DNA type establishment) Cytoplasmic maturation (mRNA and protein accumulation necessary for preimplantation development; oocyte completion at 4 weeks postnatal) is essential. The applicant's research is conducted on the 16th day after the oocyte's nucleus is fully grown, the oocyte's cytoplasm is transferred to the nucleus, and the individual's sexual maturity is established before the next generation is born. The applicant is interested in egg specific DNA sequencing, egg formation process, and nuclear transfer technology. DNA analysis of oocytes (40 ~ 44, 45 ~ 49, 50 ~ 54, 55 ~ 59, 60 ~ 64, 65 ~ 69, 70 ~ μm) from seed development stages was carried out 10, 15 and 20 days after birth. Results: Igf2r, Lit1, Zac1, and Snrpn 1 are more than 60μm, and Peg1 is more than 65μm. The egg is specific, and the time of establishment of the egg is different. For example, egg specific DNA may be used to identify egg dependent organisms. The oocyte nucleus on the way to development is very mature, the cytoplasm of the egg is very mature, the nucleus is transferred, the meiosis and the development ability after in vitro fertilization are analyzed. The oocyte in the development stage is reconstructed and the fertilized egg is produced in the development stage (8%). The above results show that the oocyte development process of the 10-day-old egg is established by 29 days (egg specific DNA development process is established by 10 days + gestation process by 19 days), and the next generation is born by 29 days (contribution to gene development process is under preparation).

项目成果

Sotomaru Y, Katsuzawa Y, Hatada I, Obata Y, Sasaki H, Kono T.: "Unregulated expression of the imprinted genes H19 and Igf2r in mouse uniparental fetuses."J.Biol.Chem.. 277. 12474-12478 (2002)

Sotomaru Y、Katsuzawa Y、Hatada I、Obata Y、Sasaki H、Kono T.：“小鼠单亲胎儿中印记基因 H19 和 Igf2r 的表达不受调节。”J.Biol.Chem.. 277. 12474-12478 (2002)

Hatada I, Kato A, Morita S, Obata Y, Nagaoka K, Sakurada A, Sato M, Horii A, Tsujimoto A, Matsubara K.: "A microarray-based method for detecting methylated loci."J.Hum.Genet.. 47. 448-451 (2002)

Hatada I、Kato A、Morita S、Obata Y、Nagaoka K、Sakurada A、Sato M、Horii A、Tsujimoto A、Matsubara K.：“基于微阵列的甲基化基因座检测方法。”J.Hum.Genet..