エンドサイトーシスを制御するユビキチン結合タンパク質複合体の立体構造解析

控制内吞作用的泛素结合蛋白复合物的三维结构分析

• 批准号: 17770097
• 负责人: 川崎 政人
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770097/
• 关键词: 分子認識; 生体分子; 蛋白質; 構造生物学; X線結晶構造解析

本研究計画では、相互作用が弱いため結晶化の困難なタンパク質複合体のX線結晶構造解析を目標とした。モノユビキチン化された膜タンパク質は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、ユビキチンを結合する一連のESCRT複合体の間を受け渡されて多胞体(multivesicular body)に取り込まれ、最終的にリソソームで分解を受ける。ユビキチンとESCRT複合体との相互作用はいずれも弱く、複合体の結晶を作るのが難しい。本研究では、これまで相互作用様式が不明であった哺乳類のESCRT II複合体とユビキチンの複合体の結晶構造解析に取り組んだ。マウスのESCRT II複合体のサブユニットであるEap45タンパク質について、様々な長さの領域の発現系を構築し、発現精製可能なユビキチン結合ドメイン(GLUEドメイン)領域を同定した。Eap45タンパク質のGLUEドメインは非常に不安定で、室温で容易に沈殿するが、低温で結晶化を行うことにより安定性の問題を克服した。大規模な結晶化条件の探索を行い、ユビキチンとGLUEドメインの複合体の結晶を得ることに成功した。放射光ビームラインにおいてX線回折データ測定を行い、3.35オングストローみ分解能のデータを収集し、分子置換法により構造解析に成功し、相互作用様式を解明することが出来た。GLUEドメインはリン脂質とも結合するが、GLUEドメインのユビキチン結合部位は、リン脂質結合部位から離れており、両者は同時にGLUEドメインと相互作用可能であることも明らかになった。

This project aims to analyze the X-ray crystallographic structure of crystalline complexes. The membrane structure of the ESCRT complex is characterized by a complex of intracellular molecules, a complex of molecules, and a complex of multicellular bodies. The interaction between the complex and ESCRT is very difficult. In this study, the interaction model of ESCRT II complex in mammals is unknown, and the crystal structure of ESCRT II complex is analyzed. The development system of ESCRT II complex is constructed, and the development refinement of ESCRT II complex can be combined with the development of GLUE domain. Eap45 is a very stable, easy to settle at room temperature, crystallization at low temperature, and stability problem. The exploration of large-scale crystallization conditions has been carried out successfully. The X-ray diffraction analysis was carried out in the radiation field, and the molecular displacement method was used to analyze the structure successfully. The interaction formula was solved. GLUE is a lipid binding site, and GLUE is a lipid binding site, and GLUE is a lipid binding site.