エンドサイトーシスを制御するユビキチン結合タンパク質複合体の立体構造解析

控制内吞作用的泛素结合蛋白复合物的三维结构分析

基本信息

批准号：
17770097
负责人：
川崎政人
金额：
$ 2.3万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770097/
关键词：
分子認識生体分子蛋白質構造生物学 X線結晶構造解析

项目摘要

本研究計画では、相互作用が弱いため結晶化の困難なタンパク質複合体のX線結晶構造解析を目標とした。モノユビキチン化された膜タンパク質は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、ユビキチンを結合する一連のESCRT複合体の間を受け渡されて多胞体(multivesicular body)に取り込まれ、最終的にリソソームで分解を受ける。ユビキチンとESCRT複合体との相互作用はいずれも弱く、複合体の結晶を作るのが難しい。本研究では、これまで相互作用様式が不明であった哺乳類のESCRT II複合体とユビキチンの複合体の結晶構造解析に取り組んだ。マウスのESCRT II複合体のサブユニットであるEap45タンパク質について、様々な長さの領域の発現系を構築し、発現精製可能なユビキチン結合ドメイン(GLUEドメイン)領域を同定した。Eap45タンパク質のGLUEドメインは非常に不安定で、室温で容易に沈殿するが、低温で結晶化を行うことにより安定性の問題を克服した。大規模な結晶化条件の探索を行い、ユビキチンとGLUEドメインの複合体の結晶を得ることに成功した。放射光ビームラインにおいてX線回折データ測定を行い、3.35オングストローみ分解能のデータを収集し、分子置換法により構造解析に成功し、相互作用様式を解明することが出来た。GLUEドメインはリン脂質とも結合するが、GLUEドメインのユビキチン結合部位は、リン脂質結合部位から離れており、両者は同時にGLUEドメインと相互作用可能であることも明らかになった。

该研究项目旨在X射线晶体结构分析蛋白质复合物，这些蛋白质复合物由于相互作用而难以结晶。单泛素化的膜蛋白通过内吞作用将其吸收到细胞中，经过一系列结合泛素并吸收到多细胞体内的ESCRT络合物，并最终在溶酶体中降解。泛素和ESCRT复合物之间的两种相互作用都很弱，因此很难形成复合物的晶体。这项研究介绍了哺乳动物ESCRT II复合物和泛素的复合物的晶体结构分析，这些复合蛋白以前具有未知的相互作用模式。对于EAP45蛋白，小鼠ESCRT II复合物的亚基，构建了各种长度的表达系统，以识别表达纯化的泛素结合结构域（胶水结构域）区域。 EAP45蛋白的胶水结构域非常不稳定，在室温下很容易沉淀，但是通过在低温下进行结晶来克服稳定性问题。我们成功地搜索了大规模的结晶条件，并获得了泛素和胶水结构域复合物的晶体。 X射线衍射数据是在同步加速器光束线上测量的，分辨率为3.35 Angstroes，并使用分子替代方法成功地分析了结构分析，从而可以阐明相互作用方法。尽管胶结构域也与磷脂结合，但胶质结构域的泛素结合位点与磷脂结合位点分离，并且还显示两者都可以同时与胶结构域相互作用。