真正細菌および古畑菌のtRNaseZにおける機能と構造の解析

真核生物のtRNase ZはtRNA前駆体の3'trailerをdiscriminator塩基の直後で切断する。原核生物酵素でもほとんどが同じ切断様式を示すが、好熱菌Thermotoga maritima(Tm)のtRNase Zは3'末端CCA配列の直後で切断する。本研究ではTm酵素によるこの特異的切断の反応機構を解明するため、以下の解析を行った。1.以前にTm酵素の31Ser、33ThrのGln置換により切断位置の上流シフトが見られたが、2つの残基を同時に置i換した変異酵素による切断箇所はWild Typeと同じであり、これらが切断位置の決定に直接的に関与していないことがわかった。一方、E.coli、T.acidphilum、P.aerophilumの酵素について、対応するGlnをSerとThrに置換したところ、切断活性がほとんど見られず、これらのGlnが切断活性に必要である事がわかった。2.以前に示した5つのアミノ酸(25Asp、48His、50His、52Asp、53His)に加え、新たに4つのアミノ酸(134His、190Asp、222His、244His)がTm酵素の切断活性に必須であることがわかった。さらに、これらのアミノ酸への置換導入酵素では、Mg^<2+>存在下で失われた基質切断活性がMn^<2+>存在下で復活することがわかった。しかし52Asp、222Hisへの置換導入酵素ではMn^<2+>による活性復活が見られなかった。これら2つのアミノ酸をpKaの異なる残基に置換した酵素のアッセイを行い、結晶構造データと合わせ、この2つのアミノ酸が切断反応でのプロトン転移に直接関与していることを明らかにした。3.Tm酵素とB.subtilis酵素のFlexible armの長さを変えた変異酵素による切断活性を比較し、この部分の長さの違いが基質との結合定数、切断位置のいずれにも影響する事を示した。

真核生物のtRNase ZはtRNA前駆体の3'trailerをdiscriminator塩基の直後で切断する。原核生物酵素でもほとんどが同じ切断様式を示すが、好熱菌Thermotoga maritima(Tm)のtRNase Zは3'末端CCA配列の直後で切断する。本研究ではTm酵素によるこの特異的切断の反応機構を解明するため、以下の解析を行った。1.以前にTm酵素の31Ser、33ThrのGln置換により切断位置の上流シフトが見られたが、2つの残基を同時に置i換した変異酵素による切断箇所はWild Typeと同じであり、これらが切断位置の決定に直接的に関与していないことがわかった。一方、E.coli、T.acidphilum、P.aerophilumの酵素について、対応するGlnをSerとThrに置換したところ、切断活性がほとんど見られず、これらのGlnが切断活性に必要である事がわかった。2.以前に示した5つのアミノ酸(25Asp、48His、50His、52Asp、53His)に加え、新たに4つのアミノ酸(134His、190Asp、222His、244His)がTm酵素の切断活性に必須であることがわかった。さらに、これらのアミノ酸への置換導入酵素では、Mg^<2+>存在下で失われた基質切断活性がMn^<2+>存在下で復活することがわかった。しかし52Asp、222Hisへの置換導入酵素ではMn^<2+>による活性復活が見られなかった。これら2つのアミノ酸をpKaの異なる残基に置換した酵素のアッセイを行い、結晶構造データと合わせ、この2つのアミノ酸が切断反応でのプロトン転移に直接関与していることを明らかにした。3.Tm酵素とB.subtilis酵素のFlexible armの長さを変えた変異酵素による切断活性を比較し、この部分の長さの違いが基質との結合定数、切断位置のいずれにも影響する事を示した。