AODアイソザイムを用いた新規異種発現系の開発と発現タンパク質の細胞内局在の制御

使用 AOD 同工酶开发新型异源表达系统并控制表达蛋白的亚细胞定位

• 批准号: 17780065
• 负责人: 中川 智行
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780065/
• 关键词: Pichia methanolica; Alcohol oxidase; Isozyme; Peroxisome; Mitochondria; Expression system; Gene expression system

本研究課題は、メチロトローフ酵母Pichia methanolicaの2種のアルコールオキシダーゼ(AOD)遺伝子プロモータを利用した新規異種遺伝子発現系の確立を目的としている。昨年度、申請者は同一細胞内で複数の有用タンパク質の発現量比・発現時期をメタノールおよび酸素濃度により自在にコントロールできる2種のAOD遺伝子プロモータを利用した異種遺伝子発現系を開発した。本年度は発現タンパク質の細胞内局在の制御の可能性について検討した。AODアイソザイムがペルオキシソーム(Ps)局在であることから、AODの細胞内輸送機構を応用して発現タンパク質をPsに集積させることが可能であると考えられる。そこでAODアイソザイムの細胞内輸送制御機構の解明、さらには発現タンパク質のPs選択的輸送について検討した。まず、AODアイソザイムのPs輸送体と考えられるPex5pの一次構造とその欠損株の表現型について解析を行った。Pex5欠損株ではAODなどPs局在型メタノール代謝酵素がPsには輸送されていなかった。つまり、Ps局在型メタノール代謝酵素はPex5pを介して輸送されており、Pex5pが認識するシグナル配列PTS1が異種発現タンパク質のPs輸送に最適であると結論付けた。そこで、PTS1を付与したGFPをAODプロモータにて発現させ、その細胞内局在を観察した。その結果、GFPは効率的にPsへ輸送され、Pex5欠損株ではPs輸送は観察されなかった。また、ミトコンドリアのタンパク質内膜輸送に関与するTim9の構造についても明らかにした。これらの結果は、2種のAODプロモータを利用した異種遺伝子発現系において発現タンパク質をPsに特異的に蓄積できることを示しており、P.methanolicaの新規異種遺伝子発現系を確立することができたものと考えている。

The purpose of this study is to establish a new heterogeneic gene development system for the utilization of two species of yeast Pichia methanolica. In the past year, the applicant has developed a heterogeneous gene production system for a plurality of useful genes in the same cell, such as the ratio of protein production to protein production, the time of protein production, and the concentration of protein. This year, the possibility of controlling the intracellular structure of the protein was investigated. The AOD system can be used to collect and store information about the intracellular transport mechanism of AOD. The understanding of the intracellular transport control mechanism of AOD system and the development of the transport control mechanism of Ps selection are discussed. The primary structure of Pex5p and the phenotype of Pex5p were analyzed. Pex5 is a defective strain. It is a metabolic enzyme. The results show that the Pex5p gene is the most suitable gene for Ps-mediated transport of Ps-related enzymes. For example, PTS1 is assigned to GFP, and AOD is displayed in the cell. The results showed that GFP was the most efficient carrier of Ps, and Pex5 was the most efficient carrier of Ps. The structure of Tim9 is related to the transport of thin films. The results showed that two kinds of AOD were used in the development of heterogeneic gene, and the new heterogeneic gene development system of P. methanolica was established

项目成果

Peroxisomal metabolism is regulated by oxygen-recognition system through the organelle-crosstalk between mitochondria and peroxisomes.

过氧化物酶体代谢由氧识别系统通过线粒体和过氧化物酶体之间的细胞器串扰来调节。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Yeast 24(In press)
• 作者: Fujimura S;Nakagawa T;Ito T;Matsufuji Y;Miyaji T;Tomizuka N
• 通讯作者: Tomizuka N

Molecular Characterization of the PEX5 gene Encoding Peroxisomal Targeting Signal 1 Receptor from the Methylotrophic Yeast Pichia methanolica.

编码来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的过氧化物酶体靶向信号 1 受体的 PEX5 基因的分子特征。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Yeast 24(In press)
• 作者: Ito T;Fujimura S;Matsufuji Y;Miyaji T;Nakagawa T;Tomizuka N
• 通讯作者: Tomizuka N

Pectin utilization by methylotrophic yeast Pichia methanolica.

甲基营养酵母甲醇毕赤酵母对果胶的利用。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Microbiology 151(6)
• 作者: Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
• 通讯作者: Nakagawa T et al.

Molecular characterization of the Tim9 homologue from the methylotrophic yeast Pichia methanolica.

来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的 Tim9 同源物的分子特征。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Yeast 23(9)
• 作者: Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N
• 通讯作者: Tomizuka N

Current Topics in Biochemistry

生物化学当前话题

• 发表时间: 2006
• 作者: Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
• 通讯作者: Nakagawa T et al.