BRETによる新規生理活性脂質受容体のリガンド同定

通过 BRET 鉴定新型生物活性脂质受体的配体

• 批准号: 17790180
• 负责人: 岸 美紀子
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790180/
• 关键词: シグナル伝達; 脂質; GPCR; BRET

前年度までに選択・作製したオーファンGPCRとルシフェラーゼの融合タンパク質をコードするプラスミドを用いた検討をさらに進めた。対象とする融合タンパク質を培養動物細胞に一過性に導入、発現させる過程で、細胞膜表面への発現が低い受容体が数種あった。これらについては7回膜貫通タンパク質であってもGPCRではなく、他の機能を持つ分子である可能性が想定された。オーファン受容体とルシフェラーゼの融合タンパク質がBRET(生体発光共鳴エネルギー転移)の系におけるエネルギードナー分子として機能するためには、一定の発現量がないとアクセプタ分子へのエネルギー転移量が不十分となり、実際には分子会合が起こっているにも関わらず、その分子会合を検出できない可能性がある。このため、ウエスタンブロットなどを用いて低発現型受容体の遺伝子導入条件を検討した。また、BRETが確認された受容体に関しては、偽陽性を排除するための条件についても検討をおこなった。具体的には、一次スクリーニングでBRET陽性であった受容体のドナー・アクセプタ比を連続的に変化させてBRET値をプロットしていき、対数関数的なBRETシグナル上昇であることを確認できれば特異的BRETと判断した。そのためのドナーおよびアクセプタの発現量や量比についての検討をおこなった。今後は、得られた知見を基にリガンド同定やGPCRの二量体化・多量体化の意義について研究を進める予定である。

In the past year, the selection process has been improved. The fusion protein is introduced into the cultured animal cells, and several kinds of receptors are found on the cell membrane. The possibility of GPCR being able to function as a molecule is determined. The fusion between the receptor and the molecule is called BRET(biological resonance), and the molecular function is called BRET(biological resonance). The molecular function is called BRET (biological resonance). This paper discusses the conditions for introducing the gene into the low-development receptor. For example, BRET is used to identify the receptor and to exclude false positives. The specific BRET value of the receptor is determined by the number of BRET positive cells, the number of BRET positive cells, and the number of BRET positive cells. The amount of time spent in the investigation is the same as that in the investigation. In the future, we will continue to study the significance of quantitative and quantitative GPCR.