胚性幹細胞(ES細胞)の分化多能性維持機構におけるNanogの機能解析

Nanogの機能を解析する為にNanog抗体を用いた免疫沈降とMass spectral analysisの解析を行なった。まず、Nanogの免疫沈降を行なう為にNanog抗体の作製、精製、と力価の検定等を行なった。得られた抗体を用いてES細胞の核抽出液よりNanogの免疫沈降を行なった。Immunoblot analysisによりNanogの免疫沈降が適正に行なわれたことを確認した。その後、実験の系をスケールアップしMassspectral analysisで解析できる量の免疫沈降産物の調整を行なった。SDS-PAGEを行ない銀染色によりNanog共沈降産物があることをコントロールと比べることで確認した。銀染色したゲルを切り出しMass spectral analysisを行なったところ多数のNanog結合蛋白質の同定に成功した。この中にはクロマチンのリモデリングに関わる因子が多く含まれていることが分かった。そのうちのいくつかの蛋白質とNanogの結合をimmunoblotにより確認したがはっきりとした結果は今のところ得られていない。さらなる解析を進める予定である。また、Nanog抗体を用いてNanogのクロマチン免疫沈降(Chip)を行ない、ES細胞の中でのNanogの標的遺伝子の同定を試みた。まずは、NanogのChipが上手くいくか条件検討を行った。非特異的なバンドの増幅が多く見られ、現在の条件ではNanog特異的な結合部位は同定できていない。バッファーの組成や、その他条件の再検討を進める予定である。

Nanogの機能を解析する為にNanog抗体を用いた免疫沈降とMass spectral analysisの解析を行なった。まず、Nanogの免疫沈降を行なう為にNanog抗体の作製、精製、と力価の検定等を行なった。得られた抗体を用いてES細胞の核抽出液よりNanogの免疫沈降を行なった。Immunoblot analysisによりNanogの免疫沈降が適正に行なわれたことを確認した。その後、実験の系をスケールアップしMassspectral analysisで解析できる量の免疫沈降産物の調整を行なった。SDS-PAGEを行ない銀染色によりNanog共沈降産物があることをコントロールと比べることで確認した。銀染色したゲルを切り出しMass spectral analysisを行なったところ多数のNanog結合蛋白質の同定に成功した。この中にはクロマチンのリモデリングに関わる因子が多く含まれていることが分かった。そのうちのいくつかの蛋白質とNanogの結合をimmunoblotにより確認したがはっきりとした結果は今のところ得られていない。さらなる解析を進める予定である。また、Nanog抗体を用いてNanogのクロマチン免疫沈降(Chip)を行ない、ES細胞の中でのNanogの標的遺伝子の同定を試みた。まずは、NanogのChipが上手くいくか条件検討を行った。非特異的なバンドの増幅が多く見られ、現在の条件ではNanog特異的な結合部位は同定できていない。バッファーの組成や、その他条件の再検討を進める予定である。