新規炭疸菌検出法の開発と感染死の法医鑑定への応用

新型炭疽检测方法的研制及其在感染死亡法医学诊断中的应用

基本信息

批准号：
17790418
负责人：
藤浪良仁
金额：
$ 2.24万
依托单位：
National Research Institute of Police Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790418/
关键词：
炭疽菌感染症法医鑑定 γファージ異同識別

项目摘要

(目的)生物テロの危険性が高まるなか、炭疽菌は高い感染力・致死率・安定性を有し、最も生物兵器として利用しやすいことから、より高感度の検出法の開発が求められている。古典的な検査法として知られているガンマファージ感染テストは、その特異性及び検出感度が高いが、炭疽菌の分離同定及び培養を必要とするため判定までに時間がかかることが欠点であった。免疫抗体を用いたELISAや免疫ストリップによる測定は迅速であるが特異性及び検出感度においてガンマファージ感染テストに及ばない。よってファージ感染テストと同等の特異性を持ちELISAや免疫ストリップの迅速性をもつ高感度検出法の確立を目指した。(方法)炭疽菌に特異的に結合するガンマファージの蛋白質(PlyG)をコードする遺伝子をクローニングし、発現プラスミドに組込んだ。これを大腸菌に導入し、GST融合タンパク質として大量発現させ、精製した。ニトロセルロース膜上に陽性対照となる炭疽菌と陰性対照となる他のバチルス属をスポットし、GST融合PlyGを反応させた後、酵素標識した抗GST抗体を反応させた。これに発光基質を加えてシグナルを検出し、特異性、検出感度を検討した。同様に芽胞化培地を用いて炭疽菌及びバチルス属の枯草菌、セレウス菌の芽胞を作製し、特異性、検出感度を検討した。(成果)GST融合PlyGおよびPlyGB(結合領域のみ)、GSTを切り離したPlyGおよびPlyGBの精製に成功した。精製したGST融合PlyGBを用いて上記の方法で結合特異性・検出感度を調べたところ、陰性対照とは全く反応することなく、炭疽菌の栄養型を特異的に検出することが出来た。また炭疽菌芽胞においても発芽を介して特異的に検出することが明らかとなった。以上より、ガンマファージのPlyGの結合領域のみをもつPlyGBが炭疽菌認識に十分な活性をもつことが明らかとなった。以上の結果をまとめた投稿論文が掲載された。

（目的）随着生物恐怖主义的风险增加，炭疽具有较高的感染性，死亡率和稳定性，并且最容易用作生物武器，因此需要开发更敏感的检测方法。伽马噬菌体感染测试（称为经典测试）具有很高的特异性和检测敏感性，但其缺点是确定伽马噬菌体感染测试需要时间，这需要分合芽孢杆菌的隔离和鉴定和培养。使用免疫抗体进行ELISA和免疫带测量很快，但在特异性和检测敏感性方面不超过伽马噬菌体感染测试。因此，我们旨在建立一种高度敏感的检测方法，该方法具有与噬菌体感染测试相同的特异性，并且具有ELISA和免疫剥离的速度。（方法）编码特异性与炭疽芽孢杆菌的γ噬菌体蛋白（PLYG）的基因被克隆并掺入表达质粒中。这被引入大肠杆菌，并以GST融合蛋白的形式广泛表示并纯化。阳性对照B.炭疽是阴性对照的，在硝酸纤维素膜上发现，另一个是阴性对照的芽孢杆菌属与GST融合plyg反应，然后将酶标记的抗GST抗体反应反应。向此添加了发光底物以检测信号，并研究了特异性和检测灵敏度。类似地，使用孢子型培养基制备了炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的孢子，并研究了特异性和检测敏感性。（结果）我们成功纯化了GST融合的Plyg和PlyGB（仅结合区域），以及GST分离的Plyg和PlyGB。当使用上述方法使用纯化的GST融合plyGB检查结合特异性和检测灵敏度时，可以特异性地检测B.炭疽芽孢杆菌的滋养型，而不会与阴性对照完全反应。还揭示了通过发芽特异性检测到的炭疽孢子。从上面可以看出，只有伽马噬菌体的结合区域的plyGB具有足够的活性来识别炭疽芽孢杆菌。提交文件总结了上述结果。