新規炭疸菌検出法の開発と感染死の法医鑑定への応用

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(目的)生物テロの危険性が高まるなか、炭疽菌は高い感染力・致死率・安定性を有し、最も生物兵器として利用しやすいことから、より高感度の検出法の開発が求められている。古典的な検査法として知られているガンマファージ感染テストは、その特異性及び検出感度が高いが、炭疽菌の分離同定及び培養を必要とするため判定までに時間がかかることが欠点であった。免疫抗体を用いたELISAや免疫ストリップによる測定は迅速であるが特異性及び検出感度においてガンマファージ感染テストに及ばない。よってファージ感染テストと同等の特異性を持ちELISAや免疫ストリップの迅速性をもつ高感度検出法の確立を目指した。(方法)炭疽菌に特異的に結合するガンマファージの蛋白質(PlyG)をコードする遺伝子をクローニングし、発現プラスミドに組込んだ。これを大腸菌に導入し、GST融合タンパク質として大量発現させ、精製した。ニトロセルロース膜上に陽性対照となる炭疽菌と陰性対照となる他のバチルス属をスポットし、GST融合PlyGを反応させた後、酵素標識した抗GST抗体を反応させた。これに発光基質を加えてシグナルを検出し、特異性、検出感度を検討した。同様に芽胞化培地を用いて炭疽菌及びバチルス属の枯草菌、セレウス菌の芽胞を作製し、特異性、検出感度を検討した。(成果)GST融合PlyGおよびPlyGB(結合領域のみ)、GSTを切り離したPlyGおよびPlyGBの精製に成功した。精製したGST融合PlyGBを用いて上記の方法で結合特異性・検出感度を調べたところ、陰性対照とは全く反応することなく、炭疽菌の栄養型を特異的に検出することが出来た。また炭疽菌芽胞においても発芽を介して特異的に検出することが明らかとなった。以上より、ガンマファージのPlyGの結合領域のみをもつPlyGBが炭疽菌認識に十分な活性をもつことが明らかとなった。以上の結果をまとめた投稿論文が掲載された。