心不全時の血管弛緩性低下におけるミオシン脱リン酸化酵素アイソフォームの役割解明

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ラットの鬱血性心不全モデルで大動脈、腸骨動脈、門脈におけるミオシン脱リン酸化酵素の調節サブユニットMYPT1がleucine zipperモチーフを有するアイソフォーム(LZ+)からleucine zipperモチーフを持たないアイソフォーム(LZ-)に変化し、それに伴いcGMPによる弛緩も減弱するという最近の報告に基づき、このアイソフォーム変化によりミオシン脱リン酸化酵素の酵素活性も変化するか検討することを目的とした。MYPT1のLZ-アイソフォームはニワトリにおいて核酸およびアミノ酸配列の報告があるがほ乳類においては報告がない。そこでまずラット小腸から精製したメッセンジャーRNAを鋳型として逆転写PCRを行い、30bpサイズの異なるアイソフォームDNAを得た。得られたDNAの塩基配列をシーケンスしたところ、ニワトリと同様スプライシングによりアイソフォームが精製されるものと考えられた。生成されるアイソフォームのアミノ酸配列はニワトリのものとは若干異なっており哺乳動物固有のアイソフォームを得た。このLZ-MYPT1アイソフォームの機能を生化学的に解析するためLZ-MYPT1全長を昆虫細胞発現系ベクターpFastBac1に挿入し、発現ウィルスを作成した。三量体からなるミオシン脱リン酸化酵素を再構成するために昆虫細胞Sf9をLZ-あるいは以前作成したLZ+アイソフォームのMYPT1を発現するバキュロウィルスとFLAGタグを融合した触媒サブユニットをPP1cを発現するウィルス、Histidineタグを融合した小サブユニットM2Oを発現するウィルスで共感染させFLAGカラムとニッケルカラムを用いたアフィニティー生成により異なるアイソフォームを持つ三量体ミオシン脱リン酸化酵素を再構成に成功した。^<32>Pラベルした平滑筋ミオシンを気質とした脱リン酸化アッセイを行いアイソフォームのホロ酵素活性に対する影響を検討中である。