心不全時の血管弛緩性低下におけるミオシン脱リン酸化酵素アイソフォームの役割解明

阐明肌球蛋白去磷酸化酶亚型在心力衰竭期间血管舒张减少中的作用

• 批准号: 17790493
• 负责人: 新納 直久
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790493/
• 关键词: 血管平滑筋; ミオシン脱リン酸化酵素

ラットの鬱血性心不全モデルで大動脈、腸骨動脈、門脈におけるミオシン脱リン酸化酵素の調節サブユニットMYPT1がleucine zipperモチーフを有するアイソフォーム(LZ+)からleucine zipperモチーフを持たないアイソフォーム(LZ-)に変化し、それに伴いcGMPによる弛緩も減弱するという最近の報告に基づき、このアイソフォーム変化によりミオシン脱リン酸化酵素の酵素活性も変化するか検討することを目的とした。MYPT1のLZ-アイソフォームはニワトリにおいて核酸およびアミノ酸配列の報告があるがほ乳類においては報告がない。そこでまずラット小腸から精製したメッセンジャーRNAを鋳型として逆転写PCRを行い、30bpサイズの異なるアイソフォームDNAを得た。得られたDNAの塩基配列をシーケンスしたところ、ニワトリと同様スプライシングによりアイソフォームが精製されるものと考えられた。生成されるアイソフォームのアミノ酸配列はニワトリのものとは若干異なっており哺乳動物固有のアイソフォームを得た。このLZ-MYPT1アイソフォームの機能を生化学的に解析するためLZ-MYPT1全長を昆虫細胞発現系ベクターpFastBac1に挿入し、発現ウィルスを作成した。三量体からなるミオシン脱リン酸化酵素を再構成するために昆虫細胞Sf9をLZ-あるいは以前作成したLZ+アイソフォームのMYPT1を発現するバキュロウィルスとFLAGタグを融合した触媒サブユニットをPP1cを発現するウィルス、Histidineタグを融合した小サブユニットM2Oを発現するウィルスで共感染させFLAGカラムとニッケルカラムを用いたアフィニティー生成により異なるアイソフォームを持つ三量体ミオシン脱リン酸化酵素を再構成に成功した。^<32>Pラベルした平滑筋ミオシンを気質とした脱リン酸化アッセイを行いアイソフォームのホロ酵素活性に対する影響を検討中である。

The regulation of the enzyme in the arteries, iliac arteries and portal veins of patients with congestive heart failure is regulated by MYPT1 and leucine zipper (LZ+). The regulation of the enzyme in the arteries, iliac arteries and portal veins is regulated by LZ+ and leucine zipper (LZ-). The enzyme activity of this enzyme is very low. MYPT1 LZ-1000 is the best solution for the problem. The DNA of the small intestine was purified by reverse transcription PCR. The DNA of the small intestine was purified by reverse transcription PCR. The DNA sequence was determined by the sequence analysis. A variety of mammalian species have been identified. The function of LZ-MYPT1 is analyzed biochemically and the whole length of LZ-MYPT1 is produced in insect cell development system FastBac1. The three components of the enzyme are reorganized into insect cells Sf9, LZ and MYPT1, which were previously created into LZ+ cells. The three components of the enzyme are also reorganized into insect cells Sf9 and LZ+ cells. Hitidine is a fusion protein that is produced by co-infection of FLAG and M2O. It is used to produce a protein that is different from M2O. <32>The effect of enzyme activity on the quality of protein and protein was studied.