新規グルココルチコイド療法創成の分子基盤の構築

构建新型糖皮质激素疗法的分子基础

• 批准号: 17790671
• 负责人: 吉川 賢忠
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790671/
• 关键词: ステロイド; 核内受容体; 転写因子; 分子生物学; 内分泌学; 薬学; 遺伝子

新規GC療法創成の分子基盤を構築するためには、GCの作用・副作用に関する各組織でのGC受容体(GR)の役割を明確化することが重要である。特に、GC薬理作用の主要標的臓器であり、ミネラルコルチコイド(MC)受容体(MR)の共発現組織である、心、脳、腎、大腸に関しては、GC, MCがGR, MRいずれにも作用しうるため、GR特異的な標的遺伝子群はいまなお明らかになっていない。そこで、これらの各組織におけるGR特異的な標的遺伝子群及びそれらの発現調節機構を明らかにすることを目的として以下の研究を進めた。1.組織特異的FLAGタグ融合グルココルチコイド受容体(FLAG-GR)過剰発現系の構築Cre-loxPシステムを用いたアデノウイルスベクターを使用し、FLAG-GR及びFLAG-MR過剰発現系を構築した。GRの役割をより明確化させるため、各種変異GRも作成した。マウスにおいて心筋、脳、大腸・腎特異的にFLAG-GRを発現させるために、各々、ミオシン軽鎖、Ca^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII、2型11β水酸化ステロイド脱水酵素のプロモーターを利用したCreリコンビナーゼ発現アデノウイルスも作製中である。2.各組織におけるGR特異的標的遺伝子の同定と制御機構の解明リガンドには、GR特異的リガンドとしてコルチバゾールを、従来型のグルココルチコイドとしてコルチコステロン、アルドステロンを用いて以下の解析を行った。(1)ラット心筋初代培養細胞を各リガンドで処理後mRNAを調整して、DNA microarray解析に付し、GR特異的制御遺伝子の候補遺伝子を得た。候補遺伝子はGRの過剰発現によるシグナルの増幅やsiRNAを用いたGRノックダウン系、GRアンタゴニストを用いた実験系を用い、定量的RT-PCR法によりGC-GR特異的な制御を確認した。標的遺伝子のプロモーター領域におけるGRの作用機構をクロマチン免疫沈降法により解明した。(2)ヒト脳、心筋、大腸、腎の各種細胞株においても同様の解析をすすめている。3.各組織におけるGR特異的標的遺伝子の発現制御機構の解明ラット心筋初代培養細胞にFLAG-GRを過剰発現させ、リガンドで処理後、核抽出液を調製し、抗FLAG抗体による免疫沈降法を行い、共沈してきたタンパクを解析して心筋特異的なGRのコファクターの同定をすすめている。

The new regulation of GC therapy creates a molecular matrix, which is important for clarifying the role of GC receptors in various tissues, as well as the effects and side effects of GC. The main target organ of GC and GC is the receptor (MR). The co-occurring tissues of GC, MC and MR are related to the heart, kidney and large intestine. GC, MC and GR are the main target organ of GC and GC. The purpose of this study is to explore the mechanism for the development and regulation of genetic diversity in different tissues. 1. Construction of tissue-specific FLAG-GR and FLAG-MR detection systems for the use of FLAG-GR and FLAG-MR. GR's service is clear, and various GR's are made. FLAG-GR is developed in muscle, intestine, and kidney specific tissues. It is used in the production of FLAG-GR, which is dependent on Ca^<2+>/Ca^<2+>/Ca^<2 +>. 2. The following analysis was conducted on the identification and control mechanism of GR-specific target genes in each organization: (1)mRNA regulation, DNA microarray analysis, GR-specific gene selection and candidate gene selection in primary culture cells of heart muscle The candidate gene was identified by quantitative RT-PCR for GC-GR-specific inhibition using GR gene system and GR gene system. The mechanism of action of GR in the target gene domain is explained by immunosedimentation method. (2)The analysis of the same cells in various cell lines of the heart, tendon, large intestine and kidney 3. FLAG-GR was detected in primary cultured cells of cardiac muscle by immunosedimentation, co-precipitation, and analysis of GR-specific target proteins.

项目成果

HEXIM1 forms a transcriptionally abortive complex with glucocorticoid receptor without involving 7SK RNA and positive transcription elongation factor b

• DOI: 10.1073/pnas.0409863102
• 发表时间: 2005-06-14
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Shimizu, N;Ouchida, R;Tanaka, H
• 通讯作者: Tanaka, H

The distinct agonistic properties of the phenylpyrazolosteroid cortivazol reveal interdomain communication within the glucocorticoid receptor.

苯基吡唑类固醇皮质醇的独特激动特性揭示了糖皮质激素受体内的域间通讯。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Molecular Endocrinology 19・5
• 作者: Yoshikawa N;Yamamoto K;Shimizu N;Yamada S;Morimoto C;Tanaka H.
• 通讯作者: Tanaka H.