卵巣癌における抗癌剤耐性機構の解明と治療への応用

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卵巣癌における抗癌剤耐性に関わる制御遺伝子の同定解析と耐性の克服について前年度より引き続きヒト卵巣癌細胞株Caov-3細胞およびA2780細胞を培養使用した。これらの細胞株にシスプラチンを投与すると細胞内情報伝達物質JNK-AP1経路が活性化され、その活性化を抑制すると卵巣癌細胞株のシスプラチン耐性性が解除され、感受性になった。このシスプラチン感受性に関与するJNK-AP1経路の標的分子を同定するため、AP-1転写因子が活性化し結合している遺伝子を、ATF2およびcJunのリン酸化特異的抗体を用いたクロマチン免疫沈降法(ChIP assay)にて抽出した。ChIP assayの特異性はnon-immue IgG抗体をnegative controlとして用いた。抽出したDNAはアダプターを付加しPCR法にて増幅した。シスプラチン投与の有無によってATF2およびcJunに結合しているDNA量は増加しており、シスプラチンによるAP-1経路の活性化がより多くの遺伝子の転写を促進していることが示唆された。シスプラチン耐性機構に重要な役割を担うDNA修復に関与するDNA修復関連遺伝子(ERCC1,ERCC3,TopoisomeraseIなど)がJNK-API経路によって活性化しているかどうかを,各遺伝子のプロモーター領域でAP1結合部位を含む領域をampliconに設定し、ChIP assayにて抽出したDNAをテンプレートとしてPCRをいった。シスプラチンによって活性化されたATF2,cJunはERCC1,ERCC3,TopoisomeraseIの転写領域に結合していた。