網膜再生に向けた視細胞の分化メカニズムの解析

【研究の目的】網膜再生においては、増殖させた網膜前駆細胞を視細胞に分化誘導する方法の開発が必要である。そのためにまず、再生過程の手本となるべき発生段階での、視細胞分化に必要な条件を、分子レベルで解明する。今回、申請者は、細胞増殖を促進するNotchシグナルが視細胞の分化を抑制し、Notchに拮抗しうる分子Numbが視細胞の分化を促進するメカニズムを、視細胞の分化に重要なcrx,ロドプシンなどの分子レベルで解析する。【研究実績】まず、in vitroで網膜にNumb、Notchなどの遺伝子を導入したり、それらの機能阻害をしたりして、視細胞の分化について解析した。視細胞が分化する時期の神経網膜の器官培養は、正常の視細胞の分化過程を良好に再現すると報告され(Tomita et al. 1996)、申請者もすでに確立した方法である。その神経網膜に、申請者が開発・報告したエレクトロポレーションの方法もしくはウイルスを使用した系により、準備した遺伝子(Numb・NotchはDr.CopanよりcDNAを供与された)をそれぞれ導入して、視細胞の発達における効果を解析した。解析のための視細胞のマーカーとしては、転写因子crxや最終分化マーカーであるロドプシンを中心とし、免疫染色、in situ hybridization、イムノブロット、リアルタイムPCRなどの手法を用いた。その結果、Numbによる視細胞への分化促進の効果を確認した。また、神経網膜の器官培養にNotchシグナルの抑制剤を添加したところ、視細胞分化が促進した。crxやロドプシンなどの発現の変化から、Numbが視細胞の分化において、どの分子レベルで影響するかを解析中である。

【研究の目的】網膜再生においては、増殖させた網膜前駆細胞を視細胞に分化誘導する方法の開発が必要である。そのためにまず、再生過程の手本となるべき発生段階での、視細胞分化に必要な条件を、分子レベルで解明する。今回、申請者は、細胞増殖を促進するNotchシグナルが視細胞の分化を抑制し、Notchに拮抗しうる分子Numbが視細胞の分化を促進するメカニズムを、視細胞の分化に重要なcrx,ロドプシンなどの分子レベルで解析する。【研究実績】まず、in vitroで網膜にNumb、Notchなどの遺伝子を導入したり、それらの機能阻害をしたりして、視細胞の分化について解析した。視細胞が分化する時期の神経網膜の器官培養は、正常の視細胞の分化過程を良好に再現すると報告され(Tomita et al. 1996)、申請者もすでに確立した方法である。その神経網膜に、申請者が開発・報告したエレクトロポレーションの方法もしくはウイルスを使用した系により、準備した遺伝子(Numb・NotchはDr.CopanよりcDNAを供与された)をそれぞれ導入して、視細胞の発達における効果を解析した。解析のための視細胞のマーカーとしては、転写因子crxや最終分化マーカーであるロドプシンを中心とし、免疫染色、in situ hybridization、イムノブロット、リアルタイムPCRなどの手法を用いた。その結果、Numbによる視細胞への分化促進の効果を確認した。また、神経網膜の器官培養にNotchシグナルの抑制剤を添加したところ、視細胞分化が促進した。crxやロドプシンなどの発現の変化から、Numbが視細胞の分化において、どの分子レベルで影響するかを解析中である。