末梢神経端側縫合部における側副神経軸索誘導の分子機構の解明

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FLRT3遺伝子よりシグナルシークエンスを除いた全長を、Nに6×HISタグをもつpET100ベクター(インビトロジェン)に組み込み、BL21内にて発現を行った。培養のライセートをXpress(インビトロジェン)タグに対する抗体でウェスタンブロットを行いFLRT3リコンビナントタンパクの発現の確認を行ったが、IPTGの誘導時より分解産物のバンドがみられた。発現タンパクの誘導を緩慢に行い、分解を抑えるように、培養温度を段階的に37度から、30度、25度、20度と低温にしたが、同様であった。さらに、IPTG濃度を1mMから、0.5mM、0.1mMをそれぞれの培養条件で行ったが、シングルバンドの増強は得られなかった。さらに培地を2×YT、LB,グルコースの添加、抗生物質をアンピシリンから、カルベニシリンへ変更を行った。しかし、結局、全長でのシングルバンドの発現は得られなかった。これらをNTAゲルにて粗生成を行い、MonoQカラム、ゲルろ過にてシングルバンドになるよう試みたが、分解産物は複数あり、どの部分で分解されるのかは特定できなかった。このため、短いフラグメントの作製することにした。FLRT3にはN末からシグナル配列、LRリピート、フィブロネクチン3類似ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、細胞内ドメインが存在する。まずは、FLRT3の細胞外ドメイン、LRリピートドメイン、フィブロネクチン3類似ドメインに分けて、pET100ベクターに組み込んだ。