積層化マイクロ培養デバイスによる電気化学的遺伝子発現アッセイ
使用堆叠微培养装置进行电化学基因表达测定
基本信息
- 批准号:17710112
- 负责人:
- 金额:$ 2.3万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
- 财政年份:2005
- 资助国家:日本
- 起止时间:2005 至 2006
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
本研究では、3次元微細化工技術とソフトリソグラフィーの融合により、プラスミドアレイ、細胞アレイ、電極アレイを積層した積層型マイクロ培養デバイスを作製し、一連の遺伝子工学操作をオンチップで行うことを試みた。電気化学測定法の利点であるリアルタイム計測と定量性に着目し、遺伝子-タンパク質発現過程を詳細に追跡した。レポーターとしてべ一タ・ガラクトシダーゼ(βGAL)やアルカリホスファターゼ(AP)を用いた。1、Maltose Binding Protein (MBP)を標的とし、野生型および変異型MBPを発現ベクターを構築し、あらかじめMBPの下流に融合させたβGALの活性を指標として標的タンパク質の可溶性・不溶性を判定するデバイスを開発した。ウェスタンブロッティングによる発現状態との比較から、電流応答とMBPの可溶性発現量がよく対応していることが示された。最終的に電極-培養ウェルー体型デバイスを作製し、発現過程のリアルタイム計測に成功した。2、酵母Two-hybrid法を利用し、リガンド依存的な核内ホルモン受容体一転写制御因子の相互作用を電気化学的に評価した。17βエストラジオールをリガンドとする酵母Two-hybridシステムにおいて、リガンド濃度依存的にβGAL由来の電流応答増加を確認した。これにより、タンパク質問相互作用の電気化学的評価が微生物チップ上で可能であることが示された。3、ウェルアレイデバイスのデザインを改良し、各ウェルに単一微生物を捕捉する条件出しを検討した。単一微生物の培養、遺伝子発現、密閉ウェル内への代謝産物の蓄積に伴う蛍光計測などに成功した。昨年度開発したOn-chip遺伝子導入デバイスにおいても、プラスミドDNAおよびホスト大腸菌濃度を最適化することにより、1コロニー/ウェルが実現可能であることが示された。電極-ウェルー体型デバイスでは、細胞活性計測(酵母〜数細胞レベル)および電場制御に基づく細胞マニピュレーション(単一細胞(大腸菌・酵母)の導入・導出)に成功した。4、動物細胞培養株を用い、3次元培養デバイス上で細胞の極性・非極性を制御し、その培養速度の違いを呼吸活性に基づく電気化学応答として追跡することに成功した。代謝活性のみならずmRNAおよびタンパク質(サイトカイン)レベルでの活性評価にも成功した。
In this study, the three-dimensional micro-chemical technology and the integration of technology, technology, cell technology, electrode technology and multilayer culture technology were studied. Electrochemistry is a method of quantitative measurement and detailed tracing of the process of qualitative development. The first time I saw it, I saw it. 1. Maltose Binding Protein (MBP) is a target protein, wild-type protein and variant MBP protein. The activity of βGAL is an indicator of the activity of MBP downstream fusion. A comparison of the state of occurrence of MBP and the solubility of MBP is made. Finally, the electrode-culture system was successfully developed and the detection process was successfully performed. 2. Yeast Two-hybrid method is used to evaluate the interaction between nuclear receptors and control factors. 17β-GAL-derived current increase was confirmed in the yeast Two-hybrid system. An Electrochemical Evaluation of Interactions between Microorganisms 3. The conditions for the capture of microorganisms in each of the three groups are discussed. The culture of single microorganism, the development of gene, the accumulation of metabolites in the closed cell, and the measurement of fluorescence were successful. The introduction of On-chip DNA into the genome was initiated last year to optimize the concentration of DNA and Escherichia coli. Cell activity measurement (yeast ~ number of cells) and electric field control (introduction/export of single cell (Escherichia coli and yeast)) were successfully performed. 4. Animal cell culture strains were successfully used in three-dimensional culture to control the polarity and non-polarity of cells, to control the respiratory activity of cells, to control the growth rate of cells, and to track the activity of cells. Metabolic activity and mRNA expression were successfully evaluated.
项目成果
期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Electrochemical screening of recombinant protein solubility in Escherichia coli using scanning electrochemical microscopy (SECM)
使用扫描电化学显微镜 (SECM) 电化学筛选重组蛋白在大肠杆菌中的溶解度
- DOI:
- 发表时间:2007
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:F.Okahara;K.Itoh;M.Ebihara;M.Kobayashi;H.Maruyama;Y.Kanaho;T.Maehama;Masaya Mitsuishi;Hiroshi Endo;Masaya Mitsuishi;M.Mitsuishi;K.Nagamine et al.
- 通讯作者:K.Nagamine et al.
Cytokine assay on a cellar chip by combining collagen gel embedded culture with scanning electrochemical microscopy
通过胶原凝胶包埋培养与扫描电化学显微镜相结合在细胞芯片上进行细胞因子测定
- DOI:
- 发表时间:2006
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Hiroki Nanjo;Tatsuya Kawahara;S.Kasai
- 通讯作者:S.Kasai
Oxygen permeability for surface-modified poly(dimethylsiloxane) characterized by scanning electrochemical microscopy
通过扫描电化学显微镜表征表面改性聚二甲基硅氧烷的透氧率
- DOI:
- 发表时间:2006
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:H.Shiku;et al.
- 通讯作者:et al.
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- DOI:
- 发表时间:2006
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:T.Yasukawa;et al.;T.Matsue
- 通讯作者:T.Matsue
Real-time monitoring of reactive oxygen species production during differentiation of human monocytic cell lines (THP-1)
- DOI:10.1016/j.aca.2005.06.034
- 发表时间:2005-09-06
- 期刊:
- 影响因子:6.2
- 作者:Kasai, S;Shiku, H;Yoshimura, T
- 通讯作者:Yoshimura, T
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