位置特異的にニトロ化したシグナル伝達蛋白質合成とそれを用いた細胞癌化機構の解明

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1.細胞内酸化ストレスによって引き起こされる癌化の機構を分子レベルで解明し、癌の予防や治療指針に役立てることを計画し実験を行った。具体的には、4塩基コドン法とフレキシザイム法を併用して、MEK蛋白質内のチロシン残基のうち特定の1カ所だけを3-ニトロチロシン残基に置換した様々な変異MEK蛋白質全て(9種類)を大腸菌抽出物中で作成し、活性評価を行った。変異MEKの自己リン酸化活性確認を調べた所、全ての変異体において活性は認められなかった。2.大腸菌抽出物のかわりに、ウサギ網状赤血球を用いて同様の実験を行ったところ、変異体ではなく野生型MEK自体が既に系中でリン酸化されてしまっており、本検出系には不適であった。3.シグナル伝達蛋白質の種類を変えて1と同様の実験を試みた。具体的には、野生型ERK蛋白質の発現を行ったが、大腸菌抽出物およびウサギ網状赤血球の両方の翻訳系において発現は認められなかった。そのため、新たな蛋白質発現系の構築を試みた。この過程で昆虫細胞抽出液中において4塩基コドン法を用いて非天然アミノ酸を蛋白質内の特定の1カ所だけに導入できることが分かり、論文発表を行った。この発現系においても、野生型ERK蛋白質の発現は認められなかった。4.本研究課題から派生したサブテーマとして、3-ニトロチロシンなどの非天然アミノ酸をフレキシザイム法等でtRNAの3'末端に結合しておき、それを用いて酵素的に様々な蛋白質のN末端1カ所だけに非天然アミノ酸を導入する新規手法を開発し、論文発表を行った。