固体材料表面への新規なタンパク質付着配向制御技術の開発

固体材料表面新型蛋白质附着方向控制技术的开发

• 批准号: 17760624
• 负责人: 今中 洋行
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17760624/
• 关键词: 付着; 親和性ペプチド; 固定化; ステンレス; ポリスチレン; クッションタンパク質; 超好熱菌; バイオ分子; 吸着等温線

固体表面との相互作用を緩和する「クッションタンパク質」として,物理的強度が高い単量体タンパク質である超好熱菌Thermococcus Kodakaraensis由来Ribonuclease HII(HII)を利用し,モデル表面としては親水性ポリスチレン(PS)およびステンレス(SUS316L)を用いて,バイオ分子の固定化特性の調査を行った.N末端に各種固体表面親和性ペプチドを連結したHIIのC末端にHis-tag(モデルペプチド) または緑色蛍光タンパク質(GFP)(モデルタンパク質)を連結した各種キメラタンパク質をそれぞれ発現,精製した.そして,まずこれらを親水性PSプレート上に固定化し,ELISAによって固定化率,検出感度を調べた.その結果,His-tagについては,表面高親和性タグ(PS-tag : RAFIASRRIKRP)+HIIに連結することで1000倍濃度のタンパク質(BSA)共存下においても優先的に表面に固定化できることがわかった.さらにHIIのC末端にフレキシブルリンカー(FL : GGGS)を挿入することにより,酵素標識抗His抗体を用いた検出の感度向上がみられた.また,GFPを固定化した場合,PS-tagだけではなくHIIも連結した方が,より強固な固定化が可能であった.一方,ステンレス表面へのペプチド(His-tag)の固定化についても検討を行ったところ,ステンレス高親和性タグ(SS-tag :ADGEGEWTSGRR)+FLに連結した場合に比べ,HIIをSS-tagとFLとの間に挿入することで,検出感度が劇的に向上した.すなわち,抗体に標識化された検出用酵素とステンレス表面との相互作用がHIIの挿入により高度に低減されたと考えられた.これらの結果から,固体表面親和性ペプチドおよびFLを連結したHIIを「クッションタンパク質」として固定化対象のバイオ分子に連結することで,各種表面上に対して,配向および構造を維持しつつ優先的かつ機能的に固定化しうることがわかった.

The interaction between solid surfaces is mitigated by physical strength, high volume, and high quality. Thermococcus Kodakaraensis is derived from Ribonuclease HII(HII) and is used by hydrophilic surface (PS) and substrate (SUS316L). Investigation of immobilization characteristics of the molecule. N-terminal His-tag(N-terminal His-tag) and green GFP (N-terminal His-tag) were linked to various surface affinity of the molecule. In addition, the hydrophilic PS was immobilized on the ELISA, and the immobilization rate and sensitivity of the ELISA were adjusted. As a result,His-tag has high affinity for surface (PS-tag : RAFIASRIKRP)+HII has high affinity for surface (PS-tag : RAFIASRIKRP)+HII has high affinity for surface (PS-tag: RAFIASRIKRP). The C-terminal of HII was identified by the enzyme and its sensitivity was increased. In the case of GFP immobilization,PS-tag is not linked to HII, and strong immobilization is possible. On the one hand, the immobilization of the surface of the substrate (His-tag) in the middle of the discussion, the substrate high affinity (SS-tag :ADGEGEWTSGRR)+FL in the case of linkage,HII SS-tag and FL in the middle of the discussion, the sensitivity is very high in the upward direction. Antibodies are identified by enzyme and surface interactions, and HII is highly reduced. As a result, the affinity of solid surface for FL is linked to HII, and the immobilization of molecules is linked to FL, and the orientation of FL is maintained on various surfaces.

项目成果

クッションタンパク質を利用したバイオ分子固定化技術の開発

利用缓冲蛋白开发生物分子固定化技术

• 发表时间: 2008
• 作者: 山隅大輔;柳田圭介;今中洋行;今村維克;中西一弘
• 通讯作者: 中西一弘

クッションタンパク質を利用したバイオ分子の固定化

使用缓冲蛋白固定生物分子

• 发表时间: 2008
• 作者: 今中洋行;山隅大輔;柳田圭介;今村維克;中西一弘
• 通讯作者: 中西一弘

ガラス高親和性ペプチドの探索とタンパク質・酵素の配向制御への応用

寻找对玻璃具有高亲和力的肽及其在控制蛋白质和酶的方向上的应用

• 发表时间: 2008
• 作者: 石村遼太;今中洋行;今村維克;中西一弘
• 通讯作者: 中西一弘

親和性ペプチドを利用したポリスチレンおよびガラス表面への蛋白質固定化とその

使用亲和肽将蛋白质固定在聚苯乙烯和玻璃表面及其

• 发表时间: 2008
• 作者: 今中洋行;上崎英範;石村遼太;熊田陽一;今村維克;中西一弘
• 通讯作者: 中西一弘

Screening and characterization of affinity peptide tags specific to polystyrene supports for the orientated immobilization of proteins

• DOI: 10.1021/bp050331l
• 发表时间: 2006-03-01
• 期刊: BIOTECHNOLOGY PROGRESS
• 影响因子: 2.9
• 作者: Kumada, Y;Tokunaga, Y;Nakanishi, K
• 通讯作者: Nakanishi, K