雄性配偶子由来セントリオールの鞭毛基底小体から中心体への機能転換に関する研究

本年度は、昨年度に引き続き、同形配偶子接合を行なう褐藻カヤモノリの配偶子、接合子を用いて、鞭毛基底小体から中心体へと機能転換する際の中心体構成既知タンパク質の局在変化(ex.セントリン、γチューブリン)について、抗体を用いた蛍光顕微鏡、及び、免疫電子顕微鏡法での観察を行なった。セントリンに関しては、鞭毛基底小体と中心体として機能する際の各々で、セントリオールへの局在箇所に変化が生じている可能性が十分に示唆された。しかしながら、γチューブリンに関しては、蛍光顕微鏡、および、電子顕微鏡での局在観察に関して、市販の抗γチューブリン抗体(SIGMA社、ポリクローナル抗体)では、ウェスタンブロットでの解析、および間接蛍光顕微鏡においては陽性反応を示すものの、電子顕微鏡用の試料上では、非特異的な反応が著しかったこともあり、局在変化を微細構造レベルでとらえることは困難であった。そのような理由もあり、褐藻カヤモノリのγチューブリンに由来する抗体を作製するため、遺伝子のクローニングを試みることとした。また、同時に、セントリオールを構築するトリプレット微小管に存在し、その構造維持に関係していることが知られている新規チューブリンと呼ばれるε(イプシロン)チューブリン遺伝子のクローニングも試みた。γチューブリンに関しては、生物間で保存性の高いアミノ酸配列部位をもとにプライマーを設計し、εチューブリンに関しては、ゲノムプロジェクトの一貫として進められている褐藻シオミドロのEST解析の情報を利用することとしてRT-PCRを行なった。εチューブリンに関しては、700bpの断片配列を得ることができ、現在、全長配列のクローニングを進めている。γチューブリンに関しては、その局在性の解析からも、細胞周期特異性が非常に強いと予想され、発現に偏りがあるため、継続して遺伝子の単離を行なっている。

本年度は、昨年度に引き続き、同形配偶子接合を行なう褐藻カヤモノリの配偶子、接合子を用いて、鞭毛基底小体から中心体へと機能転換する際の中心体構成既知タンパク質の局在変化(ex.セントリン、γチューブリン)について、抗体を用いた蛍光顕微鏡、及び、免疫電子顕微鏡法での観察を行なった。セントリンに関しては、鞭毛基底小体と中心体として機能する際の各々で、セントリオールへの局在箇所に変化が生じている可能性が十分に示唆された。しかしながら、γチューブリンに関しては、蛍光顕微鏡、および、電子顕微鏡での局在観察に関して、市販の抗γチューブリン抗体(SIGMA社、ポリクローナル抗体)では、ウェスタンブロットでの解析、および間接蛍光顕微鏡においては陽性反応を示すものの、電子顕微鏡用の試料上では、非特異的な反応が著しかったこともあり、局在変化を微細構造レベルでとらえることは困難であった。そのような理由もあり、褐藻カヤモノリのγチューブリンに由来する抗体を作製するため、遺伝子のクローニングを試みることとした。また、同時に、セントリオールを構築するトリプレット微小管に存在し、その構造維持に関係していることが知られている新規チューブリンと呼ばれるε(イプシロン)チューブリン遺伝子のクローニングも試みた。γチューブリンに関しては、生物間で保存性の高いアミノ酸配列部位をもとにプライマーを設計し、εチューブリンに関しては、ゲノムプロジェクトの一貫として進められている褐藻シオミドロのEST解析の情報を利用することとしてRT-PCRを行なった。εチューブリンに関しては、700bpの断片配列を得ることができ、現在、全長配列のクローニングを進めている。γチューブリンに関しては、その局在性の解析からも、細胞周期特異性が非常に強いと予想され、発現に偏りがあるため、継続して遺伝子の単離を行なっている。