水疱性類天疱瘡病的抗原に対するヒト型モノクローナル抗体の作成と治療への応用

本研究では、自己免疫疾患の新規治療法として、最も頻度の高い自己免疫性皮膚疾患である水疱性類天疱瘡(BP)をターゲット疾患とし、BP患者末梢血より阻害型ヒトモノクローナルFab抗体をより迅速に作成する。平成18年度は、本研究ヘエントリーするBP患者の選択、末梢血、血清の解析を行い、選択された患者から末梢血単核球を採取し、mRNAを抽出、cDNAレパトアを作成、ファージ抗体ライブラリーの作成を行った。高力価の自己抗体を有するBP患者2名から採取した末梢血から自己抗体産生B細胞を含む単核球を得た。得られた単核球からmRNAを抽出した後、PCRにてIgGのFab領域に対応する領域を増幅して抗体cDNAライブラリーを作製した。p3MHベクターにクローニングした後、大腸菌に感染させて、ファージ抗体ライブラリーを作製した。作成したファージ抗体ライブラリーを、組み換えヒトNC16Aを固相化したプレートを用いたパンニング法にてポジティブファージクローンを回収した。パンニングを2〜4度繰り返し、組み換えヒトNC16Aに対する抗原特異性の高いファージ抗体クローンを選択した。得られたファージ抗体クローンから制限酵素を用いてgeneIII領域を除去、セルフライゲーションした後に大腸菌に形質転換し、上清中に溶出したFab抗体を遠心分離にて回収した。得られたFab抗体を、組み換えヒトNC16A1-3蛋白質、組み換えヒトNC16A1蛋白質、組み換えヒトNC16A2蛋白質、組み換えヒトNC16A2.5蛋白質及び組み換えヒトNC16A3蛋白質が固相化されたプレートを用いて、HRP標識抗ヒトλ鎖抗体あるいはHRP標識抗ヒトκ鎖抗体を用いたELISA法により、エピトープマッピングを行った。その結果、NC16A2とNC16A2.5に対し反応性が高いことが判明した。

本研究では、自己免疫疾患の新規治療法として、最も頻度の高い自己免疫性皮膚疾患である水疱性類天疱瘡(BP)をターゲット疾患とし、BP患者末梢血より阻害型ヒトモノクローナルFab抗体をより迅速に作成する。平成18年度は、本研究ヘエントリーするBP患者の選択、末梢血、血清の解析を行い、選択された患者から末梢血単核球を採取し、mRNAを抽出、cDNAレパトアを作成、ファージ抗体ライブラリーの作成を行った。高力価の自己抗体を有するBP患者2名から採取した末梢血から自己抗体産生B細胞を含む単核球を得た。得られた単核球からmRNAを抽出した後、PCRにてIgGのFab領域に対応する領域を増幅して抗体cDNAライブラリーを作製した。p3MHベクターにクローニングした後、大腸菌に感染させて、ファージ抗体ライブラリーを作製した。作成したファージ抗体ライブラリーを、組み換えヒトNC16Aを固相化したプレートを用いたパンニング法にてポジティブファージクローンを回収した。パンニングを2〜4度繰り返し、組み換えヒトNC16Aに対する抗原特異性の高いファージ抗体クローンを選択した。得られたファージ抗体クローンから制限酵素を用いてgeneIII領域を除去、セルフライゲーションした後に大腸菌に形質転換し、上清中に溶出したFab抗体を遠心分離にて回収した。得られたFab抗体を、組み換えヒトNC16A1-3蛋白質、組み換えヒトNC16A1蛋白質、組み換えヒトNC16A2蛋白質、組み換えヒトNC16A2.5蛋白質及び組み換えヒトNC16A3蛋白質が固相化されたプレートを用いて、HRP標識抗ヒトλ鎖抗体あるいはHRP標識抗ヒトκ鎖抗体を用いたELISA法により、エピトープマッピングを行った。その結果、NC16A2とNC16A2.5に対し反応性が高いことが判明した。