ゼブラフィッシュ耳石基質タンパクの網羅的同定と機能解析による耳石形成機構の解明

本申請研究は、耳石形成の分子メカニズム解明のための基礎研究のうち、最も重要である耳石有機基質タンパクを網羅的に同定し、それらの発現と機能のメカニズムを、モデル生物ゼブラフィッシュを用いて明らかにする事を目的としており、まず多くの試料を採取できるニジマスを用いてイムノスクリーニング法およびペプチドマップ法により、耳石有機基質タンパクを同定した。現在までに既知の耳石基質タンパク3種を含め、イムノスクリーニングにより2種、ペプチドマップにより12種、合計14種のタンパク質の全配列を決定した(投稿準備中)。また、約700個体分のゼブラフィッシュ内耳を収集し、3フレーム全てを発現できるcDNAライブラリ(lambda TripIEX2)を作成した。また、イムノスクリーニングにより同定したタンパク質Otolith matrix macromolecule-64の機能解析を行った。このタンパクの成熟体は約64kDaのリン酸化タンパク質で、耳石の構造タンパク質Otolin-1と結合していることがわかった。この複合体はin vitroにおいてアラゴナイトの結晶を誘導することがわかった(論文1)。また、耳石基質ではないが、耳石形成に関与すると考えられるタンパク質を内耳小嚢細胞抽出液および内リンパ液から同定した。前者は炭酸脱水酵素で、耳石形成環境を整えるための炭酸輸送に関与し、そのmRNA発現に日周性があることを明らかにした。後者は、酸性のタンパク質で、非常に微量しか存在していないが、低濃度(約22pM)でin vitroにおける炭酸カルシウム形成を完全に阻害した。これらのタンパク質は耳石の石灰加速度調節およびそれによる耳石の形態形成に関与すると考えられた(論文投稿準備中)。

本申請研究は、耳石形成の分子メカニズム解明のための基礎研究のうち、最も重要である耳石有機基質タンパクを網羅的に同定し、それらの発現と機能のメカニズムを、モデル生物ゼブラフィッシュを用いて明らかにする事を目的としており、まず多くの試料を採取できるニジマスを用いてイムノスクリーニング法およびペプチドマップ法により、耳石有機基質タンパクを同定した。現在までに既知の耳石基質タンパク3種を含め、イムノスクリーニングにより2種、ペプチドマップにより12種、合計14種のタンパク質の全配列を決定した(投稿準備中)。また、約700個体分のゼブラフィッシュ内耳を収集し、3フレーム全てを発現できるcDNAライブラリ(lambda TripIEX2)を作成した。また、イムノスクリーニングにより同定したタンパク質Otolith matrix macromolecule-64の機能解析を行った。このタンパクの成熟体は約64kDaのリン酸化タンパク質で、耳石の構造タンパク質Otolin-1と結合していることがわかった。この複合体はin vitroにおいてアラゴナイトの結晶を誘導することがわかった(論文1)。また、耳石基質ではないが、耳石形成に関与すると考えられるタンパク質を内耳小嚢細胞抽出液および内リンパ液から同定した。前者は炭酸脱水酵素で、耳石形成環境を整えるための炭酸輸送に関与し、そのmRNA発現に日周性があることを明らかにした。後者は、酸性のタンパク質で、非常に微量しか存在していないが、低濃度(約22pM)でin vitroにおける炭酸カルシウム形成を完全に阻害した。これらのタンパク質は耳石の石灰加速度調節およびそれによる耳石の形態形成に関与すると考えられた(論文投稿準備中)。