電子線結晶学によるV-ATPaseの構造解析

通过电子束晶体学分析 V-ATP 酶的结构

• 批准号: 06F06185
• 负责人: 藤吉 好則
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06F06185/
• 关键词: V-ATPase; Voサブユニット; 極低温電子顕微鏡; 2次元結晶; 膜蛋白質; 電子線結晶学

イオンポンプであるV-ATPaseの結晶化を行い、その立体構造を解析する研究を進めているが、これは非常にチャレンジングな研究課題である。しかし、結晶化条件を論理的に考えて最適化することによってV-ATPaseの結晶化に成功し、投影構造の解析に成功した。V-type ATPase(V-ATPase)は、F-ATPase,A-ATPaseなどと多くのATPaseファミリーを構成する重要なエネルギー変換機能を有する膜タンパク質で、電気化学的勾配を化学エネルギーに変換するタイプのATPaseである。P-type ATPaseの高分解能構造解析やF-ATPaseのF1部分の高分解能の構造解析は行われているが、V-ATPaseの高分解能の構造は解析されていない。上記エネルギー変換の分子機構の詳細を理解するためには、V-ATPaseの高分解能の構造解析が望まれる。しかも、理想的にはこの膜タンパク質が膜に入った状態での構造が必要である。この様な高分解能の構造解析を目指して、高度好熱菌(Thermus thermophilus)からV-ATPaseを精製する系を立ち上げ、Triton X-100などの界面活性剤を検討して安定に精製できるシステムを構築した。この分子は、V1とV0ドメインが乖離する傾向にあるので、精製後できる限り素早く結晶化を試みることなどによって、色々な輻合構造の2次元結晶を作製する条件を発見した。我々の研究室には、独自に開発した極低温高分解能電子顕微鏡が設置されているので、この極低温電子顕微鏡を用いた解析のための試料作製法を検討した。現状では高分解能の立体構造解析は不可能であるが、極低温電子顕微鏡像の解析から、投影構造を解析することに成功した。その結果、現在まで議論が続いているV0ドメインのサブユニットの数について12本のヘリックスから構成されるという新しい知見を得ることに成功した。これはこれまでに知られていない新しい興味深い結果である。また、結晶性の悪い2次元結晶について、電子線トモグラフィー法を用いてその解析を行った結果、結晶性が悪くなる原因を知ることが出来た。このように、V-ATPaseの精製と2次元結晶化、それと電子線結晶学を用いた膜タンパク質の構造と機能研究について重要な研究成果を上げた。

V-ATPase Crystallization Process and Analysis of Stereoscopic Structure of V-ATPase In addition, the crystallization conditions are logically optimized, and the crystallization of V-ATPase and the analysis of projection structure are successful. V-type ATPase (V-ATPase) is composed of F-ATPase, A-ATPase and multi-ATPase. It has important function of membrane conversion, electrochemical coordination and chemical conversion. The structural analysis of high decomposition energy of P-type ATPase, F1 part of F-ATPase and V-ATPase The detailed understanding of the molecular mechanism of V-ATPase and the structural analysis of V-ATPase are also discussed. The ideal structure of the film is necessary for the film to enter the state. The structure analysis of these high decomposition energy bacteria indicates that the highly thermophilic bacteria (Thermus thermophilus), V-ATPase, purification system, Triton X-100, interfacial activity, stability and purification system are constructed. The conditions for the formation of 2-D crystals in the convergence structure of these molecules were revealed. In our laboratory, we have developed a method for preparing samples for ultra-low temperature and high resolution electron micromirrors. It is impossible to analyze the three-dimensional structure with high resolution, and the analysis of the micro-image of the ultra-low temperature electron is successful. As a result, we now discuss how to achieve this goal. This is the first time I've ever seen a woman. The results of analysis and the reasons for crystallization are presented. The important research results of V-ATPase purification, 2D crystallization and electron ray crystallography are presented in this paper.

项目成果

Structural Investigation into a rotary ATP ase/synthase by Electron Crystallography

通过电子晶体学研究旋转 ATP 酶/合酶的结构

• 发表时间: 2007
• 作者: H.T.K.Hong;A.Nose;S.Agarie;Q.Lin;Hoang Thi Kim Hong;M.Toei;クリストフ ゲーレ;C.Gerle;C.Gerle
• 通讯作者: C.Gerle

Thermus thermophilus由来のV-ATPaseのVoドメインの二次元結晶化とそのリング構造の可視化

嗜热栖热菌 V-ATP 酶 Vo 结构域的二维结晶及其环状结构的可视化

• 发表时间: 2007
• 作者: H.T.K.Hong;A.Nose;S.Agarie;Q.Lin;Hoang Thi Kim Hong;M.Toei;クリストフ ゲーレ;C.Gerle;C.Gerle;クリストフ ゲーレ
• 通讯作者: クリストフ ゲーレ

Dodecamer rotor ring defines H+/ATP ratio for ATP synthesis of prokaryotic V-ATPase from Thermus thermophilus

• DOI: 10.1073/pnas.0706914105
• 发表时间: 2007-12-18
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Toei, Masashi;Gerle, Christoph;Yokoyama, Ken
• 通讯作者: Yokoyama, Ken