電子線結晶学によるV-ATPaseの構造解析

イオンポンプであるV-ATPaseの結晶化を行い、その立体構造を解析する研究を進めているが、これは非常にチャレンジングな研究課題である。しかし、結晶化条件を論理的に考えて最適化することによってV-ATPaseの結晶化に成功し、投影構造の解析に成功した。V-type ATPase(V-ATPase)は、F-ATPase,A-ATPaseなどと多くのATPaseファミリーを構成する重要なエネルギー変換機能を有する膜タンパク質で、電気化学的勾配を化学エネルギーに変換するタイプのATPaseである。P-type ATPaseの高分解能構造解析やF-ATPaseのF1部分の高分解能の構造解析は行われているが、V-ATPaseの高分解能の構造は解析されていない。上記エネルギー変換の分子機構の詳細を理解するためには、V-ATPaseの高分解能の構造解析が望まれる。しかも、理想的にはこの膜タンパク質が膜に入った状態での構造が必要である。この様な高分解能の構造解析を目指して、高度好熱菌(Thermus thermophilus)からV-ATPaseを精製する系を立ち上げ、Triton X-100などの界面活性剤を検討して安定に精製できるシステムを構築した。この分子は、V1とV0ドメインが乖離する傾向にあるので、精製後できる限り素早く結晶化を試みることなどによって、色々な輻合構造の2次元結晶を作製する条件を発見した。我々の研究室には、独自に開発した極低温高分解能電子顕微鏡が設置されているので、この極低温電子顕微鏡を用いた解析のための試料作製法を検討した。現状では高分解能の立体構造解析は不可能であるが、極低温電子顕微鏡像の解析から、投影構造を解析することに成功した。その結果、現在まで議論が続いているV0ドメインのサブユニットの数について12本のヘリックスから構成されるという新しい知見を得ることに成功した。これはこれまでに知られていない新しい興味深い結果である。また、結晶性の悪い2次元結晶について、電子線トモグラフィー法を用いてその解析を行った結果、結晶性が悪くなる原因を知ることが出来た。このように、V-ATPaseの精製と2次元結晶化、それと電子線結晶学を用いた膜タンパク質の構造と機能研究について重要な研究成果を上げた。

イオンポンプであるV-ATPaseの結晶化を行い、その立体構造を解析する研究を進めているが、これは非常にチャレンジングな研究課題である。しかし、結晶化条件を論理的に考えて最適化することによってV-ATPaseの結晶化に成功し、投影構造の解析に成功した。V-type ATPase(V-ATPase)は、F-ATPase,A-ATPaseなどと多くのATPaseファミリーを構成する重要なエネルギー変換機能を有する膜タンパク質で、電気化学的勾配を化学エネルギーに変換するタイプのATPaseである。P-type ATPaseの高分解能構造解析やF-ATPaseのF1部分の高分解能の構造解析は行われているが、V-ATPaseの高分解能の構造は解析されていない。上記エネルギー変換の分子機構の詳細を理解するためには、V-ATPaseの高分解能の構造解析が望まれる。しかも、理想的にはこの膜タンパク質が膜に入った状態での構造が必要である。この様な高分解能の構造解析を目指して、高度好熱菌(Thermus thermophilus)からV-ATPaseを精製する系を立ち上げ、Triton X-100などの界面活性剤を検討して安定に精製できるシステムを構築した。この分子は、V1とV0ドメインが乖離する傾向にあるので、精製後できる限り素早く結晶化を試みることなどによって、色々な輻合構造の2次元結晶を作製する条件を発見した。我々の研究室には、独自に開発した極低温高分解能電子顕微鏡が設置されているので、この極低温電子顕微鏡を用いた解析のための試料作製法を検討した。現状では高分解能の立体構造解析は不可能であるが、極低温電子顕微鏡像の解析から、投影構造を解析することに成功した。その結果、現在まで議論が続いているV0ドメインのサブユニットの数について12本のヘリックスから構成されるという新しい知見を得ることに成功した。これはこれまでに知られていない新しい興味深い結果である。また、結晶性の悪い2次元結晶について、電子線トモグラフィー法を用いてその解析を行った結果、結晶性が悪くなる原因を知ることが出来た。このように、V-ATPaseの精製と2次元結晶化、それと電子線結晶学を用いた膜タンパク質の構造と機能研究について重要な研究成果を上げた。