BT菌殺虫性タンパク質から新ジャンル「タンパク質殺虫剤」を創る

1.変異体毒素ディスプレイファージライブラリーのスクリーニング現時点で最も受容体結合に重要であると考えられているCrylAa型殺虫タンパク質のドメイン2にあるループ1,2および3上の合計8箇所に関して、連続した4アミノ酸をあり得る全てのでたらめな配列にした変異体毒素をつくり、これをファージ上に提示させてライブラリーを作った。このライブラリーに対して、カイコガ幼虫の中腸に存在する受容体(BtR175)を結合させたプレートを用いてパニングを5サイクル行い、受容体に対して結合親和性が高い変異体毒素を提示するファージをスクリーニングした。2.スクリーニングで得た変異体毒素の評価上記の方法で得たCrylAa型殺虫タンパク質変異体の遺伝子をファージから取り出し、大腸菌用の発現ベクターに組み込み、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させた。それらの毒素変異体のカイコガ幼虫に対する殺虫活性をLC50を算出して評価した結果、4クローンにおいてもとのCrylAa型殺虫タンパク質より2〜3倍程度高い殺虫活性が認められた。また、これらの毒素変異体の受容体への結合性をIAsysバイオセンサーで調べたところ、結合親和性を示す一つの指標である解離定数がわずかながらも低下し、結合親和性が向上していると考えられた。これらのことからCrylAa型殺虫タンパク質のドメイン2にあるループ1,2および3が殺虫活性を向上させる目的で変異を導入する格好の候補部位であることが明らかになった。

1.変異体毒素ディスプレイファージライブラリーのスクリーニング現時点で最も受容体結合に重要であると考えられているCrylAa型殺虫タンパク質のドメイン2にあるループ1,2および3上の合計8箇所に関して、連続した4アミノ酸をあり得る全てのでたらめな配列にした変異体毒素をつくり、これをファージ上に提示させてライブラリーを作った。このライブラリーに対して、カイコガ幼虫の中腸に存在する受容体(BtR175)を結合させたプレートを用いてパニングを5サイクル行い、受容体に対して結合親和性が高い変異体毒素を提示するファージをスクリーニングした。2.スクリーニングで得た変異体毒素の評価上記の方法で得たCrylAa型殺虫タンパク質変異体の遺伝子をファージから取り出し、大腸菌用の発現ベクターに組み込み、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させた。それらの毒素変異体のカイコガ幼虫に対する殺虫活性をLC50を算出して評価した結果、4クローンにおいてもとのCrylAa型殺虫タンパク質より2〜3倍程度高い殺虫活性が認められた。また、これらの毒素変異体の受容体への結合性をIAsysバイオセンサーで調べたところ、結合親和性を示す一つの指標である解離定数がわずかながらも低下し、結合親和性が向上していると考えられた。これらのことからCrylAa型殺虫タンパク質のドメイン2にあるループ1,2および3が殺虫活性を向上させる目的で変異を導入する格好の候補部位であることが明らかになった。