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H/K-ATPaseの構造解析とイオン輸送の分子メカニズムの解析

H/K-ATPase结构分析及离子转运分子机制分析

基本信息

批准号：
06J03248
负责人：
西澤知宏
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J03248/
关键词：
P型ATPase H+,K+-ATPase 三次元構造二次元結晶極低温電子顕微鏡 P-type ATPase H K-ATPase

项目摘要

豚の胃より採取したH/K-ATPaseを用いて、これまでに確立した結晶化条件により二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡による構造解析を行うことで、6.5Åの分解能で立体構造を明らかにすることができた。同じP-typeファミリーに属するCa-ATPaseにおいては、今回の結晶化の際に加えたAlFxとADPの組み合わせはE1P-ADPの構造を模倣する阻害剤として用いられていたが、我々の立体構造はE2Pの反応中間体であることがわかった。今回明らかになったH/K-ATPaseの構造ではbサブユニットのN末端がaサブユニットのPドメイン周辺と相互作用していることが示唆されたため、この相互作用によりE2Pの構造の安定化に寄与していることが予想された。そこで、βサブユニットのN末端を欠損させた変異体を作製し、HEK細胞において野生型のαサブユニットと共発現させることで、E1P-ADPとE2Pの平衡反応にどのような影響を与えているのか機能解析を行った。その結果、βサブユニットのN末端を8アミノ酸以上欠損させた変異体では、E2PからE1P-ADPの逆反応が生じやすくなっていることが明らかになった。これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや膜輸送に関わると考えられていたが、今回の研究により酵素機能を担うαサブユニットとの相互作用により実際の酵素反応にも影響を与えるという新しい機能が明らかになった。また、今回見られた相互作用はNa/K-ATPaseの構造では見られておらず、H/K-ATPaseに特異的な機構であると考えられる。H/K-ATPaseの発現している胃壁細胞によって形成されるプロトン濃度勾配は100万倍という驚異的な値であり、これは他のトランスポーターと比較しても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによる逆反応を防ぐ仕組みがこのような特殊な性質に寄与していることが考えられる。

In the guinea pig, the H/K-ATPase was used, the crystallization conditions were confirmed, the two-dimensional structure was used as the model, the extremely low temperature micrometer was analyzed, and the decomposition of 6.5m was used to create the stereoscopic model. The same P-type system is related to the Ca-ATPase system. This time, the crystallization of the ADP system is related to the combination of the E1P-ADP model and the E2P system. The E1P-ADP model is used to prevent the damage, and the E2P system is stereoscopically designed. This time, we are going to know that we need to know that there is a problem at the end of the H/K-ATPase, that is, the interaction between the two parts of the body, the interaction, the E2P, the stabilization, the interaction, the stabilization, the stabilization. The results show that there is no significant difference between the two groups. The results show that there is no significant difference between the two groups. In this paper, the results show that the N-terminal, β-terminal, β-terminal, wild-type, negative, negative and negative. The results showed that there was no significant difference in the results between β-terminal and N-terminal, β-terminal, N-terminal, N-terminal, 8-terminal acid, E2P, E1P-ADP, E2P and E2P. In this study, we are going to be able to study the interaction of enzymes in the presence of alpha and β-enzymes. In this study, we will be able to analyze the impact of the interaction of enzymes on the basis of the results of the study on the interaction between enzymes and enzymes in the world. Today, we will see that the interaction between the two parties has been caused by the Na/K-ATPase system, and the organization of the H/K-ATPase facility is responsible for the test. H/K-ATPase