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H/K-ATPaseの構造解析とイオン輸送の分子メカニズムの解析

H/K-ATPase结构分析及离子转运分子机制分析

基本信息

批准号：
06J03248
负责人：
西澤知宏
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J03248/
关键词：
P型ATPase H+,K+-ATPase 三次元構造二次元結晶極低温電子顕微鏡 P-type ATPase H K-ATPase

项目摘要

豚の胃より採取したH/K-ATPaseを用いて、これまでに確立した結晶化条件により二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡による構造解析を行うことで、6.5Åの分解能で立体構造を明らかにすることができた。同じP-typeファミリーに属するCa-ATPaseにおいては、今回の結晶化の際に加えたAlFxとADPの組み合わせはE1P-ADPの構造を模倣する阻害剤として用いられていたが、我々の立体構造はE2Pの反応中間体であることがわかった。今回明らかになったH/K-ATPaseの構造ではbサブユニットのN末端がaサブユニットのPドメイン周辺と相互作用していることが示唆されたため、この相互作用によりE2Pの構造の安定化に寄与していることが予想された。そこで、βサブユニットのN末端を欠損させた変異体を作製し、HEK細胞において野生型のαサブユニットと共発現させることで、E1P-ADPとE2Pの平衡反応にどのような影響を与えているのか機能解析を行った。その結果、βサブユニットのN末端を8アミノ酸以上欠損させた変異体では、E2PからE1P-ADPの逆反応が生じやすくなっていることが明らかになった。これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや膜輸送に関わると考えられていたが、今回の研究により酵素機能を担うαサブユニットとの相互作用により実際の酵素反応にも影響を与えるという新しい機能が明らかになった。また、今回見られた相互作用はNa/K-ATPaseの構造では見られておらず、H/K-ATPaseに特異的な機構であると考えられる。H/K-ATPaseの発現している胃壁細胞によって形成されるプロトン濃度勾配は100万倍という驚異的な値であり、これは他のトランスポーターと比較しても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによる逆反応を防ぐ仕組みがこのような特殊な性質に寄与していることが考えられる。

The H/K-ATPase of dolphin stomach was selected and the crystallization conditions were established with the help of いて and これまでに, and the two-dimensional crystallization was produced by により, Ultra-low temperature electron micromirror structural analysis of the structure of the line うことで, 6.5Å of the resolution energy of the three-dimensional structure of the を明らかにすることができた. Same as the P-type ファミリーに belong to the するCa-ATPase においては, the crystallization of the present のinterior plus the えたAlFx とADP の group み合せThe structure of はE1P-ADP is imitated, and the structure of する is hindered by いられていたが, and the three-dimensional structure of はE2P is the reaction intermediate であることがわかった. This time Ming らかになったH/K-ATPase structure ではb サブユニットのN terminal がaサブユニットのPドメインzhou辺とphase The interaction of the interaction and the stabilization of the E2P structure and the interaction of the interaction and the stabilization of the interaction.そこで、βサブユニットのN-terminal defective させた変 allogeneic を production し、HEK cells においてwild type のαサブユニットとIt is a joint development of the させることで, E1P-ADP and E2P のbalanced reaction にどのようなeffect を and えているのかfunctional analysis を行った.そのRESULT,βサブユニットのN-terminal を8アミノacid and above defective させた変variant では, E 2PからE1P-ADPの rebel 応が生じやすくなっていることが明らかになった.これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや film conveying test Enzyme function The effect of the element is reversed and the function of the new function is clear.また、Now I see the interaction of Na/K-ATPase and the structure of Na/K-ATPase. The structure of H/K-ATPase is special. Concentration of H/K-ATPase in gastric parietal cells Comparison of the 1 million times surprising Nana and Nanaしても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによるReverse 応をanti-shi group みがこのようなSpecial nature に Send and していることが考えられる.