糖質関連酵素の機能解析と利用の検討

点击翻译按钮获取中文摘要

[緒言]糖鎖は、生物種による差異があるだけでなく、同一種においても器官、組織、細胞種等によっても大きく異なり、かつその構造、形成過程が複雑であるがために基礎的な解明さえも困難な状況にある。本研究課題では糖鎖の複雑な分子機能を解明するために統合的な解析系を確立することを骨子として掲げた。具体的に本研究では糖鎖のうち生物個体の生命維持に欠かすことのできないヒアルロン酸をターゲットとした。ヒアルロン酸は細胞外マトリックスとして組織の構築、細胞接着による細胞の足場提供に関わる細胞増殖、細胞分化、細胞移動および細胞増殖因子などの保持や提供などの制御を担っている。2糖繰り返し構造を有し、個体での半減期が非常に短い特徴をもつヒアルロン酸を合成する酵素がHyaluronan Synthase(HAS)である。HASは原核生物から真核生物まで幅広く存在しており、HASには3つのアイソフォーム(HAS1,HAS2,HAS3)が存在し、本研究ではHAS2に焦点をあてた。[結果]human由来のHAS2についてこれまでの動物細胞発現系に替わるバキュロウィルスー昆虫細胞発現系を用いて調製した。得られたHAS2含有膜画分について界面活性剤による可溶化およびリン脂質による膜の再構成を行いそれらが酵素の安定性と活性維持にどのような効果をもたらしているのか検討した。これにより哺乳動物由来のHASとしては初めて活性を保持した状態で精製することに成功した。次に精製HAS2の活性を動的光散乱(DLS)法による測定により巨大なヒアルロン酸が合成されたことを示す粒径の増大が確かめられた。これによりこれまでのラジオアイソトープ(RI)法にかわる非RI法としてDLS法による反応過程のリアルタイム測定方法を提案した。