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RNAiを用いた疾患対立遺伝子特異的発現抑制法の確立とその応用

RNAi疾病等位基因特异性表达抑制方法的建立及其应用

基本信息

批准号：
06J11231
负责人：
大西悠亮
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに2種類のレポーター遺伝子を対立遺伝子に見立てたレポーターアリルを構築し、siRNAのアリル特異性を簡便に評価できるシステムの確立を行ってきた。そして一塩基置換による変異型アリルに対して、アリル特異性を示すsiRNAは限られていることがわかった。そこで、一塩基変異型アリルに対して、siRNAのアリル特異性を改善させる改良法を検討した。プリオンタンパク質遺伝子(PRNP)に一塩基変異を持つP102L変異型をモデルアリルとして用いたところ、設計したsiRNAが正常型・変異型の両アリルの発現を強く抑制したため、siRNAに1つのミスマッチ塩基を導入した"ミスマッチ型siRNA"に改良した。それらのアリル特異性をレポーターアリルによって評価ところ、ミスマッチ塩基を導入することでアリル特異性が大きく変化した。そして様々な領域にミスマッチ塩基を導入した結果、siRNAのseed領域(ガイド鎖の2-8番目の塩基)にミスマッチ塩基を導入することで、アリル特異的なRNAi活性が強く促進することが見出された。また他のPRNPの一塩基変異であるP105LやD178N変異型アリルについても、同様にseed領域にミスマッチ塩基を導入したミスマッチ型siRNAが、強いアリル特異性を示すことを見出した。さらに、PRNPの発現ベクターを作成し、先はどのミスマッチ型siRNAが、完全長のPRNP転写産物に対してもアリル特異的な発現抑制を誘導できることを、ウエスタンプロット法により確認した。以上より本研究で構築したシステムの確立から、アリル特異性を促進させるsiRNAの改良法を見出し、一塩基置換を持つ様々な変異型アリルに対しても、アリル特異的な発現抑制を効果的に誘導できる可能性が示唆された。本研究で得られた成果は、国際紙(PLoS ONE)に発表した。

These two types of siRNA were identified by the siRNA-specific gene construct and the siRNA-specific gene was easily evaluated. The siRNA-specific gene expression vector is a variant of the siRNA-specific gene. An improved method for improving the specificity of siRNA is discussed. The expression of P102L variant gene in PRNP was improved by designing siRNA to suppress the expression of normal variant gene and variant gene. The first step is to improve the quality of the product. As a result of siRNA gene introduction into the siRNAi domain, siRNA-specific RNAi activity was strongly promoted in the siRNA-specific seed domain (2-8 gene). P105L, D178N, and other PRNP gene variants were introduced into the same seed domain, and strong PRNP specificity was demonstrated. In addition, PRNP gene expression was determined by the method of induction of PRNP gene expression inhibition. The above results demonstrate the possibility of constructing an improved siRNA approach to establish and enhance the specificity of the siRNA, and to maintain a single nucleotide substitution to inhibit the development of the siRNA. The results of this study are presented in PLoS ONE.