遺伝子ターゲティングによるイネゲノムへの任意の塩基置換変異の導入

通过基因打靶将任意碱基取代突变引入水稻基因组

• 批准号: 06J40089
• 负责人: 定塚 恵世 (久富 恵世)
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: National Institute for Basic Biology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J40089/
• 关键词: 遺伝子ターゲティング; 相同組換え; 部位特異的組換え; 変異導入; イネ; 形質転換; マーカーフリー; 点変異; 遺伝子ターダティング

本研究の目的は、相同組換えによる遺伝子ターゲティングを用いて、イネの標的遺伝子の塩基を予めデザインした塩基に置換して、遺伝子の機能解析や発現制御を行うための「塩基置換法」を開発して、イネのゲノム配列を自由に改変することである。本研究では遺伝子ターゲティングだけでなく、P1ファージのCre/lox系を用いた部位特異的組換えの技術に関しては、現在までに当該研究室では部位特異的組換え酵素Cre遺伝子を過剰発現させたイネのカルス及び植物体は、しばしば成育阻害が現れることが分かっている。そこで本課題では塩基置換用基本ベクターに組み込んだCre遺伝子は、その発現を制御できるよう、エストラジオールにて誘導できるよう工夫している。昨年度までに作成したベクターを用いて、エストラジオールによるCre遺伝子の誘導システムが有効に作用するための種々の条件を検討した。Cre遺伝子及びその発現誘導システムを有するブラスミッド(pXVE-Cre)を作成しマーカー遺伝子(ハイグロマイシン耐性遺伝子)が2つのlox配列で挟まれている構造を持ったトランスジェニックイネ(ターゲティングによりAdh2遺伝子領域内に点変異が導入されている)よりカルスを誘導して、pXVE-Creを導入した。ゲノム中にpXVE-Creをもったイネのカルスを選抜して、エストラジオール含有培地上でCre遺伝子の発現を誘導し、PCRによって2つのlox配列で挟まれているマーカー遺伝子が除去されたものを複数選抜することに成功した。さらに得られた部位特異的組換えが生じた個体の次世代を展開し、新たに導入したpXVE-CreのT-DNAも持たない完全なマーカーフリー個体を得た。この完全なマーカーフリー個体は、34bpのlox配列とターゲティングにより導入された点変異以外のゲノム構造は野生型と同等であると考えられ、相同組換えを介したターゲティングと部位特異的組換えを組み合わせて、目的の変異を任意の部位のみに導入することに成功した。これによりイネゲノムを自在に改変し点変異の様な小さな変異の導入や大規模な欠失を含むあらゆる変異を導入するための基盤技術となると期待される。従来までの、T-DNAやトランスポゾンの挿入による変異体作出、またはEMSなどの変異誘導剤による変異導入はいずれも偶然に期待して、大規模なスクリーニングを経て目的の変異体を作出・入手していたが、たとえ目的の遺伝子内に変異が導入されていても、複数のT-DNAがゲノム上に挿入していたり、また偶然に因っているために真に目的とした変異が得られる可能性は非常に低かった。しかしながら、本研究では遺伝子ターゲティングにより目的の変異をゲノム上の任意の部位に導入し、部位特異的組換えにより不要なマーカーを除去することで、真の目的通りの変異を得ることに成功した。

The purpose of this study is to develop the "base substitution method" for the functional analysis and development of the same group of genes, to freely change the sequence of genes, and to change the sequence of genes. In this study, we developed a site-specific transformation technique for the Cre/lox system, and now we have developed a site-specific transformation technique for the Cre/lox system. This topic is based on the basic concept of base substitution, which is to control and induce the occurrence of base substitution. The conditions under which Cre genes can be induced to function are discussed. Cre gene and the development of Cre gene induced by gene expression have the following characteristics (pXVE-Cre): 1. The gene expression of Cre gene and the development of Cre gene induced by gene expression of Cre gene (pXVE-Cre) have the following characteristics: 1. The gene expression of Cre gene and the development of Cre gene induced by gene expression of Cre gene (pXVE-Cre) have the following characteristics: 1. In order to successfully select the gene expression of pXVE-Cre gene, the gene expression of Cre gene was induced by PCR, and the gene expression of Cre gene was successfully removed by PCR. The new generation of T-DNA was introduced into the new generation. The complete sequence of 34bp lox sequences was successfully introduced into any site except wild-type, site-specific, and site-specific sequences. This is the first time that we've had a chance to change the way we look at it. In the future, T-DNA and T-DNA will be introduced into the genome, and the EMS will be introduced into the genome. In the future, the EMS will be introduced into the genome. The probability of the accident is very low. This study was conducted on the basis of the results of the study.

项目成果

相同組換えを介したベクターからイネゲノムへの点変異の効率的導入

通过同源重组将点突变从载体有效引入水稻基因组

• 发表时间: 2008
• 作者: Rie Terada;Yasuyo Johzuka-Hisatomi(共に第一著者);Takaki Yamauchi;定塚(久富)恵世;Yasuyo Johzuka-Hisatomi;定塚(久富)恵世;定塚(久富)恵世
• 通讯作者: 定塚(久富)恵世

Homologous Recombination-dependent Gene Targeting and an Active DNA Transposon nDart-promoted Gene Tagging for Rice Functional Genomics.

用于水稻功能基因组学的同源重组依赖性基因打靶和活性 DNA 转座子 nDart 促进的基因标记。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Rice Biology in the Gnomics Era: Biotechnology in Agriculture and Forestry 62
• 作者: 武田恵理;作間美智子;木島隆康;Yasuyo Johzuka-Hisatomi;Takaki Yamauchi;Yasuyo Johzuka-Hisatomi
• 通讯作者: Yasuyo Johzuka-Hisatomi

イネの相同組換えによる遺伝子ターゲティングにおけるベクター上の塩基置換のゲノムへの高効率の導入とミスマッチ修復

在水稻中通过同源重组高效地将载体上的碱基替换引入基因组并修复基因打靶中的错配

• 发表时间: 2008
• 作者: Rie Terada;Yasuyo Johzuka-Hisatomi(共に第一著者);Takaki Yamauchi;定塚(久富)恵世;Yasuyo Johzuka-Hisatomi;定塚(久富)恵世
• 通讯作者: 定塚(久富)恵世

Gene targeting by homologous recombination as a biotechnological tool for rice functional genomics

• DOI: 10.1104/pp.107.095992
• 发表时间: 2007-06-01
• 期刊: PLANT PHYSIOLOGY
• 影响因子: 7.4
• 作者: Terada, Rie;Johzuka-Hisatomi, Yasuyo;Iida, Shigeru
• 通讯作者: Iida, Shigeru

Alternative splicing of the rice OsMET1 genes encoding maintenance DNA methyltransferase.

• DOI: 10.1016/j.jplph.2007.12.003
• 发表时间: 2008-11
• 期刊: Journal of plant physiology
• 影响因子: 4.3
• 作者: Takaki Yamauchi;Satoru Moritoh;Y. Johzuka-Hisatomi;A. Ono;R. Terada;I. Nakamura;S. Iida