Toll様受容体4RNA遺伝子導入による樹状細胞の活性化と中耳局所免疫能の賦活化

Toll样受体4RNA基因导入激活树突状细胞并激活中耳局部免疫

• 批准号: 17791188
• 负责人: 平野 隆
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Oita University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791188/
• 关键词: Regulartory T cell; Cytokine; Toll-like receptor 4; Dendritic cell; RT-PCR; Haemophilus influenzae; otitis media; cytokine

1)急性中耳炎モデルにおける検討SPF下にて飼育した、雄性、TLR4変異マウスであるC3H/HeJマウス、およびそのwildtypeであるC3H/HeNマウスを用いた。中耳炎モデル作成後6、12、24、48、72時間後に、経鼓膜的に中耳洗浄液(250ml)を採取し、PLP固定液にて経心臓的に灌流固定し、マウス頭部を脱灰後、凍結切片(10mm)を作成した。作成した切片は抗マウスThy1.2抗体およびB220抗体にて免疫染色を行った。採取した中耳洗浄液は遠心分離し、上清はELISAに使用し、沈渣した炎症細胞は抗マウスCD3、CD4、CD8、CD25、B220抗体にて染色後、Flowcytometerにて中耳腔に遊走したリンパ球の動態について検討した。また、炎症細胞よりmRNAを抽出した後にIL-10mRNAの表出についてRT-PCRを行った。インフルエンザ菌性急性中耳炎モデルにおいて、TLR4は炎症早期より中耳腔へのリンパ球の遊走を誘導し、中耳炎急性期における、炎症反応抑制に関与するサイトカインであるIL-10の産生に関与しているものと推察された。また、TLR4欠損マウスにおいて、炎症増悪時のIL-10に対する炎症制御反応性が乏しいことからも、TLR4はIL-10に対する感受性にも関与していることが推察された。中耳腔への遊走炎症細胞の検討においては、マクロファージや樹状細胞を中心とした急性炎症を抑制する細胞である、制御性T細胞やCD4CD8共陰性であるγδT細胞が中耳の炎症に伴い増加することが今回の検討において示唆され、中耳炎との関連が示唆された。しかし、実際の中耳の炎症においては、以前我々が報告したように両マウス間での炎症反応の差は明らかであるにも関わらず、中耳腔に遊走してきたリンパ球の分画や動態においてはTLR4の関与に関わらず明らかな相違を認められなかった。今後、TLR4がどのようにこれらの細胞に関わっているのか、また炎症病態の差にどのように繋がっていくのか、さらに検討が必要であると思われた。1)TLR4欠損マウスC3H/HeJとその野生マウスC3H/HeNにおける樹上細胞の役割特異的抗原に対する2次免疫応答において、樹上細胞は重要な働きを有するが、TLR4との関連を調べるため、免疫下における鼻粘膜関連リンパ組織、頸部リンパ節、脾臓の樹上細胞の分布について検討した。樹上細胞の分布をしらべるため、C3H/HeJおよびC3H/HeNマウスにおける各リンパ組織より単核球を分離後、I-A/I-EおよびCD11cの2重染色を行い、flow cytometryにて解析を行った。各種リンパ組織中の樹上細胞の比率は、C3H/HeNマウスでは、経鼻免疫後には、I-A/I-EおよびCD11共陽性細胞、特に成熟した樹状細胞の増加を認めた。しかし、C3H/HeJマウスでは発現が抑制されていた。また、サイトカインmRNAの発現においては、両マウスともに,TGF-β,IL-5,IL-10,IL-6mRNAの発現増強を頸部リンパ節主体に認めたが、系統差は認めなかった。

1)Acute otitis media: C3H/HeJ, C3H/HeN, C3H/HeN, C 6, 12, 24, 48, 72 hours after the preparation of otitis media, the tympanic membrane of the middle ear wash fluid (250 ml) was collected, PLP fixative solution, the heart of the perfusion fixation, the head of the ash, frozen sections (10 mm) were prepared. The sections were prepared with anti-Thy1.2 and anti-B220 antibodies. Take the middle ear wash fluid to isolate, supernatant to use ELISA, sediment to inflammatory cells to resist CD3, CD4, CD8, CD25, B220 antibody to stain, Flowcytometer to middle ear cavity to detect the dynamics of the ball Also, RT-PCR was performed on the expression of IL-10 mRNA after mRNA was extracted from inflammatory cells. TLR4 is associated with the early induction of inflammation in the middle ear cavity, the early induction of ball migration, the inhibition of inflammation in the acute stage of otitis media, and the production of IL-10. TLR4 is not sensitive to inflammation, and IL-10 is sensitive to inflammation In the middle ear inflammatory cell migration process, there is an increase in the number of regulatory T cells and CD4CD8 co-negative gamma delta T cells associated with inflammation in the middle ear. In the past, I have reported that the inflammation in the middle ear is different from that in the middle ear, and the middle ear cavity is different from that in the middle ear. In the future, TLR 4 will be responsible for the development of inflammatory diseases, such as cell death, cell death, etc. 1) TLR4 deficiency in C3H/HeJ and wild C3H/HeN cells in trees is related to the secondary immune response, tree cells are related to the important immune response, TLR4 is related to the regulation, immune response, nasal mucosa related tissues, neck nodes, spleen and tree cells distribution. The distribution of cells in trees was analyzed by I-A/I-E staining and flow cytometry after separation of nuclear spheres. The percentage of tree-like cells in all kinds of tissues increased, C3H/HeN ratio increased, I-A/I-E ratio increased and CD11 ratio increased after nasal immunization. C3H/HeJ has been developed. The expression of TGF-β, IL-5, IL-10, IL-6 mRNA was increased in the neck region, and the expression of TGF-β, IL-5, IL-10, IL-6 mRNA was increased in the neck region.