DNA組換え反応の動的メカニズムの解明

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本研究では,構造生物学的,ナノバイオロジー的なアプローチを用いて,DNA組換え反応に関わる蛋白質が行う反応メカニズムを解明すること目的とし,DNA組換え反応において中心的な役割を果たしているDmc1,Rad51にフォーカスをあてて研究を進めた.まず,これらタンパク質がどのようにしてDNAと相互作用するかを明らかにすることを目的として,タンパク質とDNAとの複合体の結晶化条件の検討を行った.はじめに,これらタンパク質の大量発現系ベクターをpET系のプラスミドを用いて構築し,その後,各種クロマトグラフィーを用いて精製系を確立し,結晶化を行える純度と収量が得られる大量試料供給系を確立した.そして,精製したタンパク質を用いて,様々な配列,長さのオリゴヌクレオチドとの複合体の形成条件の検討を行った.複合体を形成する際のタンパク質とDNAとのstoichiometryや温度等の条件検討を行い,複合体形成条件の至適化を行った.検討後,明らかになった至適条件で複合体を形成させて,その複合体を用いて各種結晶化スクリーニングキットを使い,結晶化条件の検討を行った.また,Dmc1,Rad51タンパク質が関わるDNA組換え反応の詳細なメカニズムを解明することを目的として,これらの反応に関わるアクセサリー因子の解析を行った.その結果,ヒトのRad54Bタンパク質が,ヒトDmc1タンパク質の活性化因子であることがわかった.さらに,1分子ダイナミクスを行うことを目的として,Rad51,Dmc1タンパク質をその活性を失うことなく,蛍光標識する条件の検討を行った.