球状蛋白質の自由エネルギー地形とフォールディング中間体構造アンサンブルの探索

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本研究計画の目的は、蛋白質のフォールディングの物理化学的機構を解明し、特にフォールディング中間体の役割を明らかにすることである。このために、蛋白質フォールディングの速度論的研究で現在広く用いられているストップト・フロー装置よりも不感時間が二桁以上短い超高速混合連続フロー装置を作成する。連続フロー法とストップト・フロー法とを組み合わせて用いることにより、フォールディング開始後数十マイクロ秒の反応初期から天然状態に至る構造形成過程を観測する。昨年度に引き続き、装置のさらなる不感時間の短縮を目指し、装置の不感時間は約100μsに向上した。また、1-アニリノナフタレン-8-スルホン酸の蛍光をプローブに用いることにより、トリプトファンの蛍光をプローブとする場合と比べて、遙かに低い蛋白質濃度(約5μM)で観測を行えることを確認した。いくつかのモデル蛋白質について、マイクロ秒領域でのフォールディングを観測することができたものの、不感時間内に於けるシグナル変化(バースト相)が観測された。また、連続フロー法とストップト・フロー法とで観測可能な時間領域に2-3msのギャップがある。今後は、より曖昧さを排除した観測を行うために、1.より短い不感時間の連続フロー装置用溶液混合装置を作成すること、2.連続フロー法で観測できる時間領域を長くするための技術の開発、3.ストップト・フロー装置の不感時間を短縮する、の三点を解決することが必要である。