NAD依存性脱アセチル化酵素SIRT3のミトコンドリアにおける機能の解析

NAD依赖性脱乙酰酶SIRT3的线粒体功能分析

• 批准号: 18770113
• 负责人: 鈴木 寛之
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770113/
• 关键词: 酵素; 発現制御; タンパク質修飾; 老化; タンパク質就職; 細胞小器官

(研究実績)1.ヒトにおいて7種類存在するSirtuinに関して、そのcDNAを単離し、Hela細胞に発現させてその細胞内局在を検討したところ、SIRT3だけでなくSIRT4とSIRT5もミトコンドリアに局在することが分かった。またSIRT3,4,5は互いに複合体を形成しておらず、ともにミトコンドリア内マトリックスに存在する可溶性タンパク質であることが判明した。2.SIRT3,4,5のin vitro合成タンパク質と、大腸菌で発現・精製したMPP(ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ)を用いた解析により、各SirtuinはそのN末端にミトコンドリア局在化配列を有し、SIRT3は101番目のセリン、SIRT4は26番目のリジン、SIRT5は11番目のロイシンの直後でMPPにより切断され、成熟型になることが分かった。3.またSIRT4にはalternative splicingにより273bp短いshort formが存在し、ミトコンドリアではなく細胞質に局在することが分かった。現在この局在の違いによる機能の差異を調べている。4.現在までにDT40細胞を用いてミトコンドリア局在型SirtuinのうちSIRT3,4,5の各単独欠損細胞株、およびSIRT3/4,SIRT5/3,SIRT5/4の二重欠損細胞株の作製に成功している。これらの欠損細胞は全て生育可能であり、現在までに野生型との大きな表現型の違いも見られていない。現在RT-PCRなどにより、各欠損細胞において核ゲノムコードとミトコンドリアゲノムコードの違いに着目し、ミトコンドリアタンパク質の発現変化を調べている。

(Results)1. SIRT4 and SIRT5 were found to be related to the presence of 7 kinds of Sirtuin, its cDNA and Hela cells. SIRT3,4,5 is a complex formed in the presence of soluble protein. 2. SIRT3, 4, 5 in vitro synthesis of protein, Escherichia coli production, purification, MPP(single nucleotide sequence) in the use of analysis, each Sirtuin reverse N-terminal sequence of protein in the chemical alignment, SIRT3 in the 101-point sequence, SIRT4 in the 26-point sequence, SIRT5 in the 11-point sequence of MPP, separation, mature type. 3. SIRT4 is an alternative splicing domain with a 273bp short form. Now the bureau is in violation of the rules and regulations, and the differences in functions are adjusted. 4. Now, DT40 cells were successfully cultured with SIRT3,4,5 and SIRT3/4,SIRT5/3,SIRT5/4. The defective cells are not fully fertile, and the wild type is not fertile. Now RT-PCR can be used to regulate the development of quality in each defective cell.