NAD依存性脱アセチル化酵素SIRT3のミトコンドリアにおける機能の解析

(研究実績)1.ヒトにおいて7種類存在するSirtuinに関して、そのcDNAを単離し、Hela細胞に発現させてその細胞内局在を検討したところ、SIRT3だけでなくSIRT4とSIRT5もミトコンドリアに局在することが分かった。またSIRT3,4,5は互いに複合体を形成しておらず、ともにミトコンドリア内マトリックスに存在する可溶性タンパク質であることが判明した。2.SIRT3,4,5のin vitro合成タンパク質と、大腸菌で発現・精製したMPP(ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ)を用いた解析により、各SirtuinはそのN末端にミトコンドリア局在化配列を有し、SIRT3は101番目のセリン、SIRT4は26番目のリジン、SIRT5は11番目のロイシンの直後でMPPにより切断され、成熟型になることが分かった。3.またSIRT4にはalternative splicingにより273bp短いshort formが存在し、ミトコンドリアではなく細胞質に局在することが分かった。現在この局在の違いによる機能の差異を調べている。4.現在までにDT40細胞を用いてミトコンドリア局在型SirtuinのうちSIRT3,4,5の各単独欠損細胞株、およびSIRT3/4,SIRT5/3,SIRT5/4の二重欠損細胞株の作製に成功している。これらの欠損細胞は全て生育可能であり、現在までに野生型との大きな表現型の違いも見られていない。現在RT-PCRなどにより、各欠損細胞において核ゲノムコードとミトコンドリアゲノムコードの違いに着目し、ミトコンドリアタンパク質の発現変化を調べている。

(研究実績)1.ヒトにおいて7種類存在するSirtuinに関して、そのcDNAを単離し、Hela細胞に発現させてその細胞内局在を検討したところ、SIRT3だけでなくSIRT4とSIRT5もミトコンドリアに局在することが分かった。またSIRT3,4,5は互いに複合体を形成しておらず、ともにミトコンドリア内マトリックスに存在する可溶性タンパク質であることが判明した。2.SIRT3,4,5のin vitro合成タンパク質と、大腸菌で発現・精製したMPP(ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ)を用いた解析により、各SirtuinはそのN末端にミトコンドリア局在化配列を有し、SIRT3は101番目のセリン、SIRT4は26番目のリジン、SIRT5は11番目のロイシンの直後でMPPにより切断され、成熟型になることが分かった。3.またSIRT4にはalternative splicingにより273bp短いshort formが存在し、ミトコンドリアではなく細胞質に局在することが分かった。現在この局在の違いによる機能の差異を調べている。4.現在までにDT40細胞を用いてミトコンドリア局在型SirtuinのうちSIRT3,4,5の各単独欠損細胞株、およびSIRT3/4,SIRT5/3,SIRT5/4の二重欠損細胞株の作製に成功している。これらの欠損細胞は全て生育可能であり、現在までに野生型との大きな表現型の違いも見られていない。現在RT-PCRなどにより、各欠損細胞において核ゲノムコードとミトコンドリアゲノムコードの違いに着目し、ミトコンドリアタンパク質の発現変化を調べている。