リポ多糖認識に伴う生体膜融合及び分泌機構の分子基盤解析

脂多糖识别相关生物膜融合和分泌机制的分子基础分析

基本信息

批准号：
18770137
负责人：
小柴琢己
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、カブトガニ顆粒細胞のリポ多糖(LPS)認識により誘導される生体膜融合を通じて、生体防御の分子機構を理解することを目標とした。カブトガニの顆粒細胞は、大腸菌やサルモネラ菌などのグラム陰性菌表層主成分であるLPSに対して非常に敏感に反応することから、何らかのLPS受容体が顆粒細胞上に存在し、その後の生体防御機構へとつながると以前から考えられてきた。平成18年度において、研究代表者らはそのLPS受容体がセリンプロテアーゼ前駆体であるFactor Cである事を突き止め、そのLPS認識において分子のN末端領域に存在する領域がLPS結合に寄与していることを明らかにした。この結果をもとに平成19年度においては、この結合の物理化学的な特性、ならびにその生理的な意義について調べた。まず、このLPSとの結合に必須なFactor CのN末端領域(約300アミノ酸)を昆虫細胞にて、組換え蛋白質として発現させ、その後の精製を行い、LPS(Lipid A)との結合をBIACOREにより測定した。この組換え蛋白質は、非常に強くLPSとの結合を示し、得られた結合定数は約5x10^<-9>(M)であった。次に、この組換え蛋白質を用いて、Factor CとLPSとの結合にDominant Negativeな働きをするかについて免疫沈降法により、解析を行った。その結果、組換え蛋白質濃度を増加していくにしたがってその結合を阻害することが示された。これらの結果は、Factor CのN末端領域が直接的にLPSとの結合に働き、Factor Cの機能発現に大きく関与している事を示したものである。

这项研究旨在通过脂多糖识别（LPS）识别在马蹄蟹颗粒细胞中诱导的生物膜融合来了解生物防御的分子机制。由于马蹄蟹颗粒细胞对LPS非常敏感，这是革兰氏阴性细菌表面的主要成分，例如大肠杆菌和沙门氏菌，长期以来一直认为某种LPS受体在颗粒细胞上存在，导致随后的生物保护机制。 2006年，研究人员发现LPS受体是丝氨酸蛋白酶前体C因子C，并揭示了该分子N末端区域中存在的区域有助于LPS识别中的LPS结合。基于这些结果，在2007年，我们研究了该键的物理化学特性及其生理意义。首先，对于与LPS结合至关重要的因子C的N末端区域（约300个氨基酸）被表示为昆虫细胞中的重组蛋白，然后纯化，并通过Biacore测量与LPS（脂质A）的结合。这种重组蛋白与LPs表现出非常强的结合，所得的结合常数约为5x10^<-9>（m）。接下来，使用该重组蛋白，通过免疫沉淀以显性负方式进行了因子C与LPS的结合。结果表明，随着重组蛋白的浓度增加，它抑制其结合。这些结果表明，因子C的N末端区域直接在与LP的结合中起作用，并且很大程度上参与了因子C的功能表达。