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高等脊椎動物における新規セントロメア蛋白質の同定および機能解析

高等脊椎动物新型着丝粒蛋白的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
18770159
负责人：
岡田聖裕
金额：
$ 2.37万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770159/
关键词：
セントロメア CENP-C 蛋白質精製キネトコア DT40

项目摘要

染色体分配に必須のセントロメア構造を形成する蛋白質の中で、セントロメア蛋白質CENP-Cは、セントロメア機能に必須であるが、その機能が全く解明されていなかった。CENP-Cの機能を明らかにすることは、セントロメア構造の機能発現機構を理解する上で極めて重要であると考えられる。そこで、CENP-Cの機能を分子レベルで解明するために、CENP-Cと相互作用する蛋白質の精製と同定を行った。ニワトリDT40細胞を用いて、CENP-C遺伝子の条件的ノックアウト細胞株を作製し、それにGFPタグを融合したCENP-Cを発現する遺伝子を導入した細胞株を構築した。この細胞株をノックアウト条件で培養することで、タグと融合したCENP-C蛋白質だけが細胞内に存在するという状態を作り出すことによって、純度の高い蛋白質精製を実行した。抗GFP抗体を用いて免疫沈降を行い、得られた蛋白質をSDS-PAGEによって分離し、銀染色によって可視化したところ、十種類以上の蛋白質が得られた。それらのバンドを切り出して質量分析法によって蛋白質の同定を行い、多数のCENP-Cと結合する蛋白質を見いだした。その中には、スプライシング因子やhnRNP等が含まれていた。セントロメア構造の維持には、セントロメア領域からの転写産物が重要であると考えられており、見いだされた蛋白質は、そのような転写産物の機能発現に関与しているものと考えられる。その他に、蛋白質キナーゼ複合体がCENP-Cと強く結合していることを見いだした。複数のセントロメア蛋白質にはそのキナーゼ複合体の認識アミノ酸配列が含まれていることから、セントロメア蛋白質のリン酸化による機能制御が行われている可能性を示唆するものと考えられる。このように、CENP-Cの結合蛋白質を同定することによって、セントロメア構造の機能制御に関与すると考えられる多数の蛋白質群を見いだすことができ、本研究は当初の計画通り順調に進行した。

Chromosome allocation is essential for the formation of protein structures, protein CENP-C is essential for chromosome function, and all functions are fully understood. CENP-C's function is very important to understand the structure and function of CENP-C. The function of CENP-C in protein purification and identification Cell lines were constructed using the CENP-C gene as a vector for cell fusion and CENP-C gene expression. The cell strain was cultured under conditions of fusion and purification of CENP-C protein. Anti-GFP antibodies were detected by SDS-PAGE, and more than ten proteins were detected. The protein identity and most of the CENP-C binding proteins were identified by mass spectrometry. In the middle of the game, there are many factors such as hnRNP, etc. The maintenance of the protein structure is important for the development of the protein structure. The protein complex CENP-C strongly binds to the protein. A study on the possibility of functional regulation of protein complex in the presence of complex acid. This study was carried out in accordance with the original plan.