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マウスD-アスパラギン酸オキシダーゼの遺伝子クローニングとその変異体解析

小鼠D-天冬氨酸氧化酶基因克隆及其突变体分析

基本信息

批准号：
18790062
负责人：
片根真澄
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

D-アスパラギン酸(D-Asp)、N-メチルーD-AspおよびD-グルタミン酸といった酸性D-アミノ酸を立体特異的に分解する生体内酸化酵素として、D-アスパラギン酸オキシダーゼ(DDO)が知られている。ホモロジーモデリング法により構築したマウスDDOの推測三次元構造より活性部位に位置することが予測されたSer-308残基に着目し、この残基の側鎖の水酸基が持つ役割を解明することを目的として、site-directed mutagenesisによるマウスDDOの変異体解析を行った。Ser-308残基がGly、AlaあるいはTyrに置換されたマウスDDOをGST、HisおよびSタグがN末に付加された融合蛋白質として大腸菌で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。各変異体の酵素学的機能を調べた結果、側鎖に水酸基を持たないGly-308およびAla-308変異体のD-AspおよびN-メチル-D-Aspに対する触媒効率は野生型酵素と比較して有意に上昇しており、また、補酵素FADに対する親和性も上昇していた。一方、野生型酵素と同様に側鎖に水酸基を持つTyr-308変異体は、D-AspおよびN-メチル-D-Aspに対する触媒効率、および補酵素FADに対する親和性が有意に低下していた。Gly-308変異体に関しては、HisタグのみがN末に付加された融合蛋白質を用いた解析も行い、同様の結果が得られることを確認した。本研究結果より、Ser-308残基がマウスDDOの機能発現に関与する重要なアミノ酸残基であることが明らかになった。また、この残基の側鎖の水酸基は、反応速度、基質との結合、およびFADとの結合に対して抑制的に機能していることが示唆された。

D - アスパラギン acid (D - Asp), N - メチルー D - Asp および D - グルタミン acid といった acid D - アミを three-dimensional specific にノ acid decomposition する born in acidification enzyme として, D - アスパラギン acid オキシダーゼ (DDO) が know られている. ホモロジーモデリング method により build したマウス DDO の speculated that the three dimensional structure より active site に position することが be された Ser - 308 residues に mesh し, この residues の side chain acid base がの water cut を hold つ service interpret することを purpose として, site - directed mutagenesisによるによるウスDDO <s:1> variant analysis を line った. Ser - 308 residues が Gly, Ala あるいは Tyr に replacement されたマウス DDO を GST, ihs および S タグが N に pay at the end of the add された fusion protein として coliform で発 now させ, アフィニティークロマトグラフィーにより refined した. Each - learn the function of allograft の enzyme を adjustable べにた results, side lock water acid radical を hold たない Gly - 308 および Ala - 308 - variant の D - Asp および N - メチル - D - Asp にす seaborne る catalyst working rate は wild-type enzyme と compare して intentionally に rise しており, また, enzyme FAD にす seaborne る affinity も rise してい Youdaoplaceholder0. Side, wild-type enzyme と with others に side chain acid base をに water holding つ Tyr 1-308 - は, D - Asp および N - メチル - D - Asp にす seaborne る catalyst working rate, および repair enzyme FAD にす seaborne る affinity が deliberately low にしていた. Gly - 308 - variant に masato しては, ihs タグのみが N に pay at the end of the add された fusion protein をいた parsing もい, with others in the result of のがられることを confirm した. This study より, Ser - 308 residues がマウス DDO の function 発 now に masato and する important なアミノ acid residues であることが Ming らかになった. また, この residues のの side lock water, acid base は応 speed, matrix との combination, および FAD との combining にし seaborne て inhibit に function していることが in stopping された.