脱ヨード酵素遺伝子転写調節機構を利用した選択的甲状腺ホルモン作用調節因子の探索

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ヒト末梢白血球よりゲノムを抽出し,PCR法を用いてヒト脱ヨード酵素1型(D1)遺伝子5'上流域(2kbp)をクローニングした。これを鋳型としてPCR法により種々の長さの欠失を有するヒトD1遺伝子5'上流域をルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とするプラスミドに組み込んでコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトをヒト肝臓由来細胞株へ一過性に導入しレポーター活性を測定したところ,翻訳開始点より-225〜177bpの間で活性が変化した。一方,ヒト腎臓由来細胞株および子宮頚癌由来細胞株では上記領域での活性変化はほとんど認めたなかったことから,これらの領域は肝臓特異的にヒトD1遺伝子プロモーター活性が変化する領域であると考えられた。コンピューター検索により上記領域には肝臓特異的な転写因子であるC/EBPの結合領域が存在したため,当該部位に変異を導入したコンストラクトを作製し同様にレポーター活性を測定したところ,変異を導入していない(野生型)コンストラクトと比較して活性が変化した。この結果に基づきc/EBPαのsiRNAを作製し肝臓由来細胞株へ一過性に導入しヒトD1遺伝子発現の変化を定量PCR法で検討を行ったが,ヒトD1遺伝子発現に変化を認めなかった。また,当該結合領域をプローブとし肝臓由来細胞株から抽出した核タンパクを用いて行ったゲルシフトアッセイにても当該領域への核タンパクの結合は認められなかった。以上の結果より,上記の領域へのC/EBPαの直接的結合は認められず,C/EBPαがヒトD1遺伝子の転写調節に関与している可能性は低いと考えられ,同領域にC/EBPの他のアイソフォームもしくは他の(転写)因子が結合することによりヒトD1遺伝子の転写調節に関与している可能性が考えられた。