強皮症のHGF遺伝子プラスミドを用いた遺伝子療法の臨床的応用

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(1)HGF遺伝子プラスミド投与による皮膚硬化抑制の解析ブレオマイシン(BLM)をC3Hマウスに4週間、連日皮下注射し硬化を誘導。その後、ヒトHGF cDNA(2.2Kb)をvector plasmidに挿入後、HJV-liposomeに組み込み10mcg/mouse筋肉内に2週間ごとに2回投与しPBSを筋肉内に投与した群と4週間後に比較検討した。BLM最終投与4週間後に、背部皮膚を切除し組織学的に検討した。一部の実験ではホルマリン固定した組織標本において、H＆E染色以外にトルイジンプルー、ギムザ、コンゴレッド染色を各々施行し、硬化病変部における皮膚の厚さと結合織の変化を検討したとことHGFプラスミド投与群では減少していた。また、皮膚ハイドロキシプロリン量をWoessnerの方法を用いて測定したところHGFプラスミド投与群で明らかにハイドロオキシプロリン量が減少していた。さらに、human HGFがmRNA、蛋白レベルで発現しているかを明らかにするため皮膚、肺、筋肉、腎臓などの臓器の抽出液および血清よりRT-PCR法、ELISA法を用いて測定したところ産生が確認できた。HGFの発現分布を検討するため、抗ヒトHGF抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。さらに、皮膚におけるTGF一β1の発現レベルを測定するためELISA, RT-PCR法を用いてmRNA,蛋白レベルで定量した。(2)HGF遺伝子によるサイトカインの動態の検討HGF遺伝子プラスミドあるいはコントロールプラスミドを投与した強皮症マウスの皮膚をそれぞれ採取し、発現されているサイトカイン(TGF-β,PDGF, CTGF, IL-6,IL-4,IL-5,bNGFなど)をRT-PCR法と免疫組織法を用いて検討したところHGFプラスミド投与群でTGF-βの発現が減少していた。HGF投与してそれぞれに皮膚におけるサイトカイン発現を検討し、主要な役割をはたすサイトカインがTGF-βであることを明らかにした。また、同時に、それらの操作によって出現する局所浸潤細胞を検討し、主役を務める炎症細胞が肥満細胞であることが明らかになった。