構造学的手法の包括的利用によるクロマチンリモデリング機構の解明

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前年度で提案したクロマチンリモデリング因子FACT天然変性(ID)領域のリン酸化によるヌクレオソームDNA結合阻害の分子機構をより確かなものにするために、下記の実験を行った。リン酸化部位の同定には二次元電気泳動を新たに用いて確認した。また、DNA及び分子内酸性ID領域へのHMGドメインの結合はHMGのN末端に存在する塩基性ID断片が必要である事を生化学実験により確認した。これはFACT塩基性ID断片の重要性を示したはじめての例である。以上の内容をまとめて、論文として発表した。(Tsunaka et al., J.Biol.Chem.(2009))新たな実験として、リン酸化ID領域と、非リン酸化状態とでHMGドメインへの相互作用に差異が存在するのかをNMRにより解析したが、大きな変化は検出されなかった。おそらく、リン酸基が導入される事でHMGドメインとの結合に特異性が生まれるのではなく、単純に負電荷が増加する事で結合が強化される事が示唆された。さらにFACTとヌクレオソームとの複合体の高速AFM観察を行った。しかし、期待されたような観察像は得られなかった。おそらく、基盤との吸着による複合体の破壊が観察を困難にしており、この問題を解決する必要がある。この問題を解決するために、Buffer条件の検討や脂質二重膜など新たな基盤を試したが、解決には至らなかった。また、これまでの結果から、ID領域でのリン酸化、脱リン酸化がFACTの構造変化を引き起こして、機能を発揮している事が強く示唆された。そこで、FACTのリン酸化IDと、脱リン酸化IDを高速AFM観察する事で比較し、リン酸化によるID領域の構造変化を可視化する事を目指した。しかし、これについても基盤との吸着の問題で明確に比較検討できる条件を見つける事ができなかった。