tRNA依存アミド基転移酵素GatCABが持つアンモニアチャネルの制御機構の解明

昨年度,GatCAB単体の結晶化条件の最適化により,GatCAB単体の構造解析を1.9Å分解能で行うことに成功した,得られたGatCAB全長の立体構造とGatDE-tRNA^<Gln>複合体の立体構造を利用することでGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルを作成した.次に作成したGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルにおいて,tRNA^<Gln>の認識に関与すると予想される部位に注目し一次構造比較を行ったところ,GatBのcradle domainとC-tail domainにGatCABに特徴的な配列を見いだすことに成功した.この2つの特徴的な配列とtRNA^<Gln>認識の関係を明らかにするために,様々なGatCAB変異体を作成し,結合活性測定を行った.その結果,GatBのcradle domainに存在する3_<10>ヘリックスとC-tail domainの保存されたGlyがtRNA^<Gln>認識に重要であることが明らかになった.今年度は,変異体解析によりアンモニアチャネル制御機構の解明も目指した.活性測定は今年度作成した大腸菌in vivo活性測定系を用いた.Glu-tRNA^<Gln>を合成するND-GluRSを大腸菌で発現させると,Glu-tRNA^<Gln>は大腸菌には毒性を示すため大腸菌は生育できない.しかし,同時にGatCABを発現させると,Glu-tRNA^<Gln>はGln-tRNA^<Gln>へ変換され毒性が回避される.大腸菌in vivo活性測定系は大腸菌にND-GluRSとGatCAB変異体を共発現し,GatCAB変異体の機能が阻害されると,大腸菌の生育が遅くなることを利用して変異箇所の評価を行う.実際,活性測定を行った結果,アンモニアチャネルを制御しているゲート(E125)は立体障害でアンモニアチャネルを制御していると考えていたが,直接アンモニアの輸送に関与していることが示唆された.

昨年度,GatCAB単体の結晶化条件の最適化により,GatCAB単体の構造解析を1.9Å分解能で行うことに成功した,得られたGatCAB全長の立体構造とGatDE-tRNA^<Gln>複合体の立体構造を利用することでGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルを作成した.次に作成したGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルにおいて,tRNA^<Gln>の認識に関与すると予想される部位に注目し一次構造比較を行ったところ,GatBのcradle domainとC-tail domainにGatCABに特徴的な配列を見いだすことに成功した.この2つの特徴的な配列とtRNA^<Gln>認識の関係を明らかにするために,様々なGatCAB変異体を作成し,結合活性測定を行った.その結果,GatBのcradle domainに存在する3_<10>ヘリックスとC-tail domainの保存されたGlyがtRNA^<Gln>認識に重要であることが明らかになった.今年度は,変異体解析によりアンモニアチャネル制御機構の解明も目指した.活性測定は今年度作成した大腸菌in vivo活性測定系を用いた.Glu-tRNA^<Gln>を合成するND-GluRSを大腸菌で発現させると,Glu-tRNA^<Gln>は大腸菌には毒性を示すため大腸菌は生育できない.しかし,同時にGatCABを発現させると,Glu-tRNA^<Gln>はGln-tRNA^<Gln>へ変換され毒性が回避される.大腸菌in vivo活性測定系は大腸菌にND-GluRSとGatCAB変異体を共発現し,GatCAB変異体の機能が阻害されると,大腸菌の生育が遅くなることを利用して変異箇所の評価を行う.実際,活性測定を行った結果,アンモニアチャネルを制御しているゲート(E125)は立体障害でアンモニアチャネルを制御していると考えていたが,直接アンモニアの輸送に関与していることが示唆された.