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セリウム触媒を利用した人工制限酵素の高機能化および遺伝子操作への応用

使用铈催化剂改善人工限制性酶的功能并将其应用于基因操作

基本信息

批准号：
07J03030
负责人：
愛場雄一郎
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子組換え技術は、遺伝子の本体であるDNAを位置選択的に切断し、他の遺伝子と連結することで達成される。しかし、DNA切断に用いられる天然制限酵素は、切断位置が限定されたり、選択性が不十分であったりと、ゲノムなどの巨大DNAを扱うツールとしては不十分であった。これに対し我々は、DNA加水分解触媒Ce(IV)/EDTAとPNA(ペプチド核酸)を併用し、天然を超える高い位置特異性と自由度を有した人工制限酵素の構築を行ってきた。本研究では、さらに高度な遺伝子操作に向けた汎用的なツールとして完成させるべく、切断効率・選択性をより向上させた次世代の人工制限酵素の構築を目指した。今年度は、DNA配列認識部位であるPNAにリンカーを導入し、その認識能が配列全体として向上していることを明らかにした(投稿作業中)。さらに本系を発展させ、機能性リンカーを用いたPNAへの新機能付与にも成功した(論文1、2)。また、EDTP配位子とCeとの相互作用を利用して切断効率の大幅な向上に成功し、その切断機構の解明も行った(論文3)。現在は、PNAへの配位子修飾へと展開が行われている。EDTP以外にもCeとの強い相互作用を示すポリアミン系錯体のPNA導入に成功し、切断の高効率化が確認されており、今後のさらなる展開が期待される。上記の結果はいずれも、本系を次世代の遺伝子操作ツールとして今後展開していく上で非常に重要な知見である。巨大DNAを対象とし長鎖PNAを用いる場合では、複数のリンカーを導入してミスマッチ識別能を向上させたり、EDTPなどの配位子を修飾したPNAを用いたりすることで、さらなる切断効率の向上が期待される。このように本人工制限酵素をさらに発展させ、より高い活性・選択性でDNAを位置選択的に切断する技術が確立されることで、従来は達成が困難であった遺伝子操作などへの応用が期待される。

Heritage 伝 subgroups in はえ technology, but 伝の ontology である DNA を position sentaku に cut し link, he の but 伝とすることで reached される. しかし, DNA cut にいられるがは, the limitations of natural enzyme cut position limit されたり, sentaku が not quite であったりと, ゲノムなどの huge DNA を Cha うツールとしては not quite であった. これにし seaborne I 々は, DNA hydrolytic decomposition catalyst Ce (IV)/EDTA と PNA (ペプチド nucleic acid) を and し, natural をえる high specificity と dof をい position し limitations た artificial enzyme の line build をってきた. This study では, さらに traces of highly な伝 sub operations に to けた of universal なツールとして complete させるべく, cut off the working rate, sentaku をより upward させた nextgen limitations の artificial enzyme の build を refers した. Our は "で, DNA match column know parts ある PNA にリンカーを import し, その can know が go all として upward していることを Ming らかにした contribute (homework). さらに department を発 exhibition させ, functional リンカーを with いた PNA への new function give にも successful した (paper 1, 2). また, EDTP ligand と Ce とのを interaction using してのなにし success up sharply cut sharper rate, その cutting institutions の interpret も line った (article 3). Now へ, PNAへ the coordinate position modifier へと expands the が line われてるるる. Strong outside EDTP にも Ce とのいを interaction in すポリアミン is misprinted の PNA import にし success, to cut off the の high rate of unseen が confirm されており, future のさらなる expand が expect される. Written の results はいずれも, the department を nextgen の heritage 伝 sub operations ツールとして in future expansion していくで very important なに on knowledge である. Huge DNA を like と seaborne し long locks PNA を with いる occasions では, plural のリンカーを import してミスマッチ can identify を upward させたり, EDTP などの ligand を modified した PNA を with いたりすることで, さらなるの cut sharper rate upward が expect される. Limitations このように this artificial enzyme をさらに発 exhibition させ, より high い activity, sentaku で DNA を position sentaku に cut する technology が establish されることで, difficulty 従は to achieve がであった heritage 伝 sub operations などへの応 with が expect される.