ASK1-ASK2複合体の機能解析および,ASK1阻害剤によるASK1の機能解析

ASK1-ASK2 复合物的功能分析以及使用 ASK1 抑制剂对 ASK1 的功能分析

基本信息

批准号：
07J03314
负责人：
梅田剛
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞のストレス受容・伝達メカニズムを、MAPキナーゼ経路を中心としたシグナル伝達機構の視点から解明することを目的としている。特にMAPKKK分子であるASKファミリー分子について研究を行っており、昨年度に引き続き、今年度は新規ASKファミリー分子であるASK3についてRNAiスクリーニングによる活性制御因子探索を行った。ショウジョウバエ培養細胞を用いた、小規模スクリーニングの結果から、PPMファミリーに属する複数の脱リン酸化酵素がASK3の活性を変化させることが明らかとなった。それら遺伝子のヒトにおける相同遺伝子をヒト培養細胞において共発現させたところ、ASK3を脱リン酸化することが分かった。ASK3は浸透圧ストレスに対して、低浸透圧では活性化し、高浸透圧では不活性化されるという両方向性の挙動を示すことが分かっている。これらのストレスによる活性変化に、この脱リン酸化酵素が関わっているかを検討するため、siRNAを用いたヒト細胞におけるノックダウン実験を行った。その結果、これらの脱リン酸化酵素は、低浸透圧応答時におけるASK3および下流のp38経路の活性を負に制御していることが明らかとなった。しかし、高浸透圧におけるASK3の不活性化への寄与は小さいことも明らかとなった。そこで、高浸透圧における浸透圧受容・伝達のコンポーネントを網羅的に同定するために、全ゲノムを対象にしたRNAiスクリーニング系の確立を試みた。スクリーニング対象の生物種はヒトとし、siRNAライブラリー約18000種を用いてノックダウンを行うこととした。ASK3の活性評価方法としては、96ウェルおよび384ウェルプレートを用いた蛍光免疫染色法によりASK3のリン酸化とタンパク発現を定量することに成功した。今後は、実際にスクリーニングを行い、浸透圧シグナルの伝達機構の構成因子が明らかになると考えられる。

目的是从信号转导机制的角度阐明压力接收和细胞传播的机制，以MAP激酶途径为中心。特别是，我们正在对MAPKKK分子的Ask家族分子进行研究，而在去年，今年我们通过RNAi筛选搜索了新的Ask Family分子Ask3的活动调节因素。使用培养的果蝇细胞进行小规模筛查的结果表明，属于PPM家族的多种去磷酸化酶会改变Ask3的活性。当这些基因的同源基因在人培养细胞中共表达时，发现Ask3被脱磷酸化。已经发现，Ask3以双向方式行为，其中在低渗透压下被激活并在高渗透压下灭活。为了研究这种去磷酸化酶是否参与了这些应激诱导的活性变化，使用siRNA在人类细胞中进行了敲低实验。结果，发现这些去磷酸化酶对低湿反应期间的Ask3和下游p38途径的活性负调节。但是，还显示出高渗透压下对Ask3的贡献很小。因此，为了全面识别高渗透压下的渗透感和传播的成分，我们试图建立一个针对整个基因组的RNAi筛选系统。要筛选的物种是人类的，使用大约18,000个siRNA文库进行敲低。作为评估Ask3活性的方法，我们通过使用96孔和384孔板通过荧光免疫染色成功地量化了ASK3的磷酸化和蛋白质表达。人们认为，将来将进行实际筛选以揭示渗透信号传递机制的组成因素。