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ASK1-ASK2複合体の機能解析および,ASK1阻害剤によるASK1の機能解析

ASK1-ASK2 复合物的功能分析以及使用 ASK1 抑制剂对 ASK1 的功能分析

基本信息

批准号：
07J03314
负责人：
梅田剛
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞のストレス受容・伝達メカニズムを、MAPキナーゼ経路を中心としたシグナル伝達機構の視点から解明することを目的としている。特にMAPKKK分子であるASKファミリー分子について研究を行っており、昨年度に引き続き、今年度は新規ASKファミリー分子であるASK3についてRNAiスクリーニングによる活性制御因子探索を行った。ショウジョウバエ培養細胞を用いた、小規模スクリーニングの結果から、PPMファミリーに属する複数の脱リン酸化酵素がASK3の活性を変化させることが明らかとなった。それら遺伝子のヒトにおける相同遺伝子をヒト培養細胞において共発現させたところ、ASK3を脱リン酸化することが分かった。ASK3は浸透圧ストレスに対して、低浸透圧では活性化し、高浸透圧では不活性化されるという両方向性の挙動を示すことが分かっている。これらのストレスによる活性変化に、この脱リン酸化酵素が関わっているかを検討するため、siRNAを用いたヒト細胞におけるノックダウン実験を行った。その結果、これらの脱リン酸化酵素は、低浸透圧応答時におけるASK3および下流のp38経路の活性を負に制御していることが明らかとなった。しかし、高浸透圧におけるASK3の不活性化への寄与は小さいことも明らかとなった。そこで、高浸透圧における浸透圧受容・伝達のコンポーネントを網羅的に同定するために、全ゲノムを対象にしたRNAiスクリーニング系の確立を試みた。スクリーニング対象の生物種はヒトとし、siRNAライブラリー約18000種を用いてノックダウンを行うこととした。ASK3の活性評価方法としては、96ウェルおよび384ウェルプレートを用いた蛍光免疫染色法によりASK3のリン酸化とタンパク発現を定量することに成功した。今後は、実際にスクリーニングを行い、浸透圧シグナルの伝達機構の構成因子が明らかになると考えられる。

The cell phone receives the message, the MAP receives the message, the center receives the message, the organization receives the message, the goal receives the message. Special MAPKKK molecular research, last year's introduction, this year's new ASK molecular research, ASK3 molecular research, active control factors exploration The activity of ASK3 was changed by PPM, a complex deacidifying enzyme, which was used to culture cells in small scale. The same gene was detected in cultured cells, and ASK3 was detected in cultured cells. ASK3 is activated at low saturation pressure and deactivated at high saturation pressure. The activity of these enzymes is regulated by siRNA. As a result, the activity of ASK3 and downstream p38 pathways was negatively controlled by the enzyme in the presence of low osmotic pressure. ASK3 Inactivation and Inactivation of ASK 3 For example, if a high penetration pressure is detected, the penetration pressure is detected. About 18000 species of siRNAs are used in the production of siRNAs. ASK3 activity was evaluated successfully by using a light immunostaining method. In the future, the actual situation will be changed, the penetration pressure will be changed, and the constituent factors of the transmission mechanism will be changed.