ASK1-ASK2複合体の機能解析および,ASK1阻害剤によるASK1の機能解析

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細胞のストレス受容・伝達メカニズムを、MAPキナーゼ経路を中心としたシグナル伝達機構の視点から解明することを目的としている。特にMAPKKK分子であるASKファミリー分子について研究を行っており、昨年度に引き続き、今年度は新規ASKファミリー分子であるASK3についてRNAiスクリーニングによる活性制御因子探索を行った。ショウジョウバエ培養細胞を用いた、小規模スクリーニングの結果から、PPMファミリーに属する複数の脱リン酸化酵素がASK3の活性を変化させることが明らかとなった。それら遺伝子のヒトにおける相同遺伝子をヒト培養細胞において共発現させたところ、ASK3を脱リン酸化することが分かった。ASK3は浸透圧ストレスに対して、低浸透圧では活性化し、高浸透圧では不活性化されるという両方向性の挙動を示すことが分かっている。これらのストレスによる活性変化に、この脱リン酸化酵素が関わっているかを検討するため、siRNAを用いたヒト細胞におけるノックダウン実験を行った。その結果、これらの脱リン酸化酵素は、低浸透圧応答時におけるASK3および下流のp38経路の活性を負に制御していることが明らかとなった。しかし、高浸透圧におけるASK3の不活性化への寄与は小さいことも明らかとなった。そこで、高浸透圧における浸透圧受容・伝達のコンポーネントを網羅的に同定するために、全ゲノムを対象にしたRNAiスクリーニング系の確立を試みた。スクリーニング対象の生物種はヒトとし、siRNAライブラリー約18000種を用いてノックダウンを行うこととした。ASK3の活性評価方法としては、96ウェルおよび384ウェルプレートを用いた蛍光免疫染色法によりASK3のリン酸化とタンパク発現を定量することに成功した。今後は、実際にスクリーニングを行い、浸透圧シグナルの伝達機構の構成因子が明らかになると考えられる。