環境試料からの遺伝子資源の探索に向けた未知有用遺伝子の迅速取得手法の開発

未知有用基因快速获取方法开发，从环境样本中寻找遗传资源

• 批准号: 07J04723
• 负责人: 寺原 猛
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J04723/
• 关键词: メタゲノム; 遺伝子資源探索; Inverse PCR法; Locked nucleic acid; phi29 DNA polymerase; T-RFLP法; 多次元尺度法; inverse PCR法; リパーゼ遺伝子

環境試料からの新規遺伝子取得手法としてPre-amplified Inverse-PCR法(PAI-PCR法)を考案した。本手法は相補鎖塩基に対して通常のDNAオリゴよりも特異性の高いLocked nucleic acid(LNA)オリゴとphi29 DNA polymeraseを使用し、ターゲット遺伝子が含まれる環状DNAのみを選択的に鎖置換反応で増幅し、その産物をinverse PCR法の鋳型DNA鎖として利用するのが特長である。大腸菌ゲノムDNA中のλDNAをターゲット遺伝子とし、模擬環境試料を用いてPAI-PCR法の効果を検証した。その結果、これまでのinverse PCR法の約1,000倍の感度でターゲット遺伝子を検出可能であることを確認した。この成果は環境試料からの新規遺伝子を取得するメタゲノム研究の新たな道筋として、幅広い研究・産業分野において活用できる可能性を示している。次に、本手法を用いて様々な環境試料(活性汚泥、土壌、虫垂、堆肥)から新規遺伝子の取得を試みた。その結果、既知のリパーゼ遺伝子と35-80%の相同性(アミノ酸ベース)を示す推定リパーゼ遺伝子を13個取得し、さらに機能解析を行ったところ、既知遺伝子とは異なる活性を示した。一方、環境試料から多様な新規遺伝子を効率的に取得するためには、各サンプルのターゲット遺伝子の多様性を把握することが、その一助になると考えた。そこで、15種類の耕地土壌を用い、bacterial chitinasesをターゲットにしてT-RFLP法で多様性を簡易に把握することができるのかを検討した。クローニングを介した統計解析(UniFrac analysis)とT-RFLP法を介した統計解析(多次元尺度法)を比較した結果、T-RFLP法で遺伝子の多様性を簡易に把握できることが示唆された。

A new method for obtaining environmental samples was developed using the Pre-amplified Inverse-PCR (PAI-PCR) method. This method uses a complementary DNA sequence, a highly specific DNA sequence (LNA) sequence, and phi29 DNA polymerase to amplify DNA sequences containing circular DNA sequences. The results of PAI-PCR were verified by using simulated environmental samples. The results of inverse PCR were approximately 1,000 times more sensitive than those of the previous method. The results of this study demonstrate the possibility of new technologies and applications for environmental testing, research, and industrial differentiation. In addition, this method is used to obtain new environmental samples (activated sludge, soil, insects and compost). The results showed that there were 35-80% identity between known and unknown genes, and 13 putative genes were obtained, and functional analysis was carried out. A party, environmental samples from a variety of new genetic efficiency of the acquisition, the various types of genetic diversity to grasp, and so on. The diversity of 15 species of cultivated soil and bacterial chitinases was easily understood by T-RFLP. UniFrac analysis and T-RFLP analysis were used to compare the results and T-RFLP analysis was used to analyze the diversity of the gene.

项目成果

Retrieval of entire genes from environmental DNA by inverse PCR with pre-amplification of target genes using primers containing locked nucleic acids.

使用含有锁定核酸的引物预先放大靶基因，通过逆PCR从环境DNA中检索整个基因。

• DOI: 10.1111/j.1462-2920.2007.01518.x
• 发表时间: 2008-04
• 期刊: ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY
• 影响因子: 5.1
• 作者: Yamada, Kazutaka;Terahara, Takeshi;Kurata, Shinya;Yokomaku, Toyokazu;Tsuneda, Satoshi;Harayama, Shigeaki
• 通讯作者: Harayama, Shigeaki

Molecular diversity of bacterial chitinases in arable soils and the effects of environmental factors on the chitinolytic bacterial community

耕地土壤细菌几丁质酶的分子多样性及环境因素对几丁质分解细菌群落的影响

• 发表时间: 2009
• 期刊: Soil Biology and Biochemistry 41(3)
• 作者: Takeshi Terahara;Seishi Ikeda;Chiaki Noritake;Kiwamu Minamisawa;Katsuhiko Ando;Satoshi Tsuneda;Shieaki Harayama
• 通讯作者: Shieaki Harayama

Pre-amplified inverse PCRを用いた環境試料からの新規リパーゼ遺伝子の取得

使用预扩增反向 PCR 从环境样品中获取新型脂肪酶基因

• 发表时间: 2008
• 作者: 寺原猛;他5名
• 通讯作者: 他5名

Pre-amplified inverse PCRを用いた環境試料からの新規エステラーゼ遺伝子の取得

使用预扩增反向 PCR 从环境样品中获取新型酯酶基因

• 发表时间: 2009
• 作者: 寺原猛;他3名
• 通讯作者: 他3名

Sequence-based approachによる環境試料からの新規遺伝子の探索

使用基于序列的方法从环境样本中搜索新基因

• 发表时间: 2007
• 作者: 寺原 猛;他5名
• 通讯作者: 他5名