蛋白質、DNAの電子顕微鏡観察用特異標識法の開発

蛋白质和DNA电子显微镜特异性标记方法的开发

• 批准号: 07J05949
• 负责人: LOUKANOV Alexandre R (2008)
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The Graduate University for Advanced Studies
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J05949/
• 关键词: 電子顕微鏡; 抗体ラベル; レプリカ; シナプス; ナノ粒子; 凍結割断レプリカ; X線エネルギー分散検出走査; 高角度暗視野走査透過電子顕微鏡(HAADF-STEM)

本研究目的は金コロイドやQdotなどのナノ粒子を電顕用ラベルとして用い、細胞膜上や細胞内のDNAや蛋白質を特異的に標識することである。金粒子やQdotの合成は自分自身の専門である有機化学で行えるが、生物学や生理学は不慣れなので生物試料を扱うことを得意とする生理研の脳科学専門家との共同研究を始めた。共同研究の中で火急のテーマとして神経シナプス上の受容体の種別ごとの分布決定が未解決とわかり、その問題解決のための特異的標識法開発を行った。具体的には神経シナプス凍結判断のレプリカに対しQdot抗体、金抗体を用いて後シナプス表面の受容体の電顕像における弁別標識を行う研究である。電子顕微鏡の手法としてはレプリカ像上でラベル剤の元素弁別を行うEDX(エネルギー分解X線分光法)とレプリカ像全体を観察するSTEM(走査透過電子顕微鏡)を組みあわせる新手法を適用した(当初計画の位相差電顕法はEDXとの折り合いが悪くSTEMに切り替えることになった)。元素弁別を容易にするため白金を含まない炭素レプリカ法を考案し、STEMで充分高いコントラストが生ずることを示した。次に5nmという同一粒子サイズの金コロイド、Qdotを用いそれぞれNMDA抗体、AMPA抗体に結合させ蛋白質弁別的抗体ラベルを行った。この結果2つの受容体はEDX像において明確に異なる分布を示すことが元素弁別ラベル標識により示された。今回開発の手法は神経脳科学分野の電顕的新手法であるので学会発表を行い、また博士の学位取得することができた。

The purpose of this study is to identify specific DNA and proteins on cell membranes and in cells. The synthesis of gold particles and Qdots is a separate branch of organic chemistry, and biology and physiology are not accustomed to using biological samples. This is the beginning of joint research between physiological researchers and scientists. To jointly study the distribution of receptor species in the brain, and to develop specific identification methods for solving unresolved problems. Specific research on the identification of Qdot antibody and gold antibody in the detection of brain freeze was conducted. The method of electron microscope is applied to the element classification of EDX(X-ray spectroscopy) and STEM(investigation through electron microscope). Elements are easy to identify, platinum is easy to contain, carbon is easy to identify, STEM is easy to identify, carbon is easy to identify, STEM is easy to identify, carbon is easy to identify, STEM is easy to identify. NMDA antibody, AMPA antibody, protein class antibody, etc. are used in the same particle. The results show that the content of the two receptors is clearly different from that of the EDX image. The new method developed in this paper is a new method for the division of science and technology.