PI 3-kinaseによる開口放出制御機構の解明

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本研究では、ホスファチジルイノシトールリン酸化酵素PI 3-kinaseが神経伝達物質放出を制御する分子機構を解明することを目的としている。本年度は、昨年確立した抗体を化学架橋した磁気ビーズを用いる単離法によって、Vesicular glutamate transporter (VGluT)を含む興奮性シナプス小胞、Vesicular GABA transporter (VGAT)を含む抑制性シナプス小胞を精製した。精製したそれぞれの小胞タンパク質をSDS-PAGEし、CBB染色した。結果、数十種類のタンパク質を提示できた。ほとんどのタンパク質は2種類の小胞間で共通であったが異なるタンパク質も存在した。質量分析器を用いてこれらタンパク質の解析を行った。また、ホスファチジルイノシートルリン脂質に結合するとされるPICK1およびそのファミリータンパク質が神経伝達物質放出制御に関与しているかの検討を行った。その結果、PICK1およびファミリータンパク質Arfaptin 2がシナプス小胞に結合していることがわかった。またArfaptin 2をPC12細胞に強制発現させると神経伝達物質放出が抑制されることが明らかとなった。次にArfaptin 2 にはPI 3-kinaseの下流にあるProtein kinase B のリン酸化サイトがあるので、そのサイトに対するリン酸化抗体を作製した。作製した抗体を用いてウエスタンブロッテイングによる解析を行った。さらに免疫沈降実験からPICK1に小胞輸送にICA69が結合していることを見出した。