食品製造現場や環境中における糞便汚染指標大腸菌の迅速定量法

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大腸菌はヒトや動物の腸管内に存在するため、食品の糞便汚染を示す指標として広く認知され、食品の衛生検査法として定着している。しかしながらその検査法は、乳糖発酵管を用いた最画数法という多大な試験管を必要とする培養検査、また複数の培地を用いた確定検査からなり、多くの労力と時間を要している。本研究では、これらの実態を鑑み、食品製造の現場において広く行われている大腸菌の検査法をより簡便、迅速に行えるよう、分子生物学的手法を取り入れ、実際の製造工程で実施可能なシステムを構築することを目的とし、研究を遂行した。実際の食品製造の現場や環境中から糞便汚染指標菌である大腸菌を迅速に検出、定量を行うためには、リアルタイムPCR法がもっとも有効な手法であると考え、リアルタイムPCR法で大腸菌を検出するためのプライマー、プローブセットの構築を行った。プライマープローブセットは、大腸菌のみを効率よく検出、定量するため、大腸菌が持っuidA遺伝子配列中に設計し、この検出・定量系が大腸菌にのみに特異的に反応することを確認した。特異性の確認には、各種食品などから広く収集した細菌を用い、確立したプライマーセットが大腸菌を迅速に検出できる方法として、実用レベルにあることを確認した。また、各種食品に段階的に希釈した大腸菌を接種し、接種した食品から細菌DNAを抽出し、これをリアルタイムPCRに供することで、食品から直接大腸菌を定量するための検量線を作成した。さらに、もうひとつの応用例として、大腸菌判別用の簡易培地上からの確定試験法についても研究を行い、確立したリアルタイムPCR法を組み合わせることで、生育してきた大腸菌様コロニーを迅速に確定することができる方法も確立した。