配列相補性に依存しない機能性ncRNA『天然アプタマー』の網羅的探索

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当該年度では、前年度に検討・最適化を行った、培養細胞からのRNAプールの作製方法、選別されたRNAの両末端にPCR増幅用のプライマー配列を付加する方法、鎖長の違いに由来するPCR増幅効率のバイアスを低減させる方法(HANDS法)を応用して、SELEX法による天然アプタマー探索のためのモデル実験を行った。モデル実験の標的蛋白質としては、相互作用するRNA因子が既知であるHEXIM1ならびにU1Aを、ヒスチジン・タグとストレプトアビジン親和性ペプチドとの融合蛋白質として、大腸菌で過剰発現させたものをもちいた。また、初期プールとしては、ヒト培養細胞(HeLa細胞)より抽出した全RNAをもちいた。それぞれの標的について、1ラウンド目の選別の前に、あらかじめプールRNAにプライマー配列の付加を行う方法と、選別後に配列付加を行う方法の2種類の方法を検討した。選別の際の担体としては、ニッケル親和性担体ならびにストレプトアビジン担体を、交互にもちいた。それぞれの条件で5ラウンドのSELEXを行い、取得されたクローンの配列を解析した結果、選別前にあらかじめ配列付加を行う方法において、期待された通り、HEXIM1と相互作用する7SK snRNAならびにU1Aと相互作用するU1 snRNAが多数取得された。一方、配列付加の前に選別を行う方法では、7SK snRNAは11クローン中わずか1クローンしか取得されなかった。また、U1 snRNAは多数取得されたものの、全て一部を欠損したクローンであった。これらの結果から、あらかじめ配列付加を行う方法によって、効率的に天然アプタマーの取得が可能である事が示唆された。以上、前年度からの一連の研究によって、SELEX技術をべースとした天然アプタマーの探索システムの確立が達成された。