配列相補性に依存しない機能性ncRNA『天然アプタマー』の網羅的探索

全面寻找不依赖于序列互补性的功能性ncRNA“天然适配体”

• 批准号: 18710162
• 负责人: 大内 将司
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18710162/
• 关键词: ncRNA; アプタマー; ゲノム; SELEX; ゲノム調節

当該年度では、前年度に検討・最適化を行った、培養細胞からのRNAプールの作製方法、選別されたRNAの両末端にPCR増幅用のプライマー配列を付加する方法、鎖長の違いに由来するPCR増幅効率のバイアスを低減させる方法(HANDS法)を応用して、SELEX法による天然アプタマー探索のためのモデル実験を行った。モデル実験の標的蛋白質としては、相互作用するRNA因子が既知であるHEXIM1ならびにU1Aを、ヒスチジン・タグとストレプトアビジン親和性ペプチドとの融合蛋白質として、大腸菌で過剰発現させたものをもちいた。また、初期プールとしては、ヒト培養細胞(HeLa細胞)より抽出した全RNAをもちいた。それぞれの標的について、1ラウンド目の選別の前に、あらかじめプールRNAにプライマー配列の付加を行う方法と、選別後に配列付加を行う方法の2種類の方法を検討した。選別の際の担体としては、ニッケル親和性担体ならびにストレプトアビジン担体を、交互にもちいた。それぞれの条件で5ラウンドのSELEXを行い、取得されたクローンの配列を解析した結果、選別前にあらかじめ配列付加を行う方法において、期待された通り、HEXIM1と相互作用する7SK snRNAならびにU1Aと相互作用するU1 snRNAが多数取得された。一方、配列付加の前に選別を行う方法では、7SK snRNAは11クローン中わずか1クローンしか取得されなかった。また、U1 snRNAは多数取得されたものの、全て一部を欠損したクローンであった。これらの結果から、あらかじめ配列付加を行う方法によって、効率的に天然アプタマーの取得が可能である事が示唆された。以上、前年度からの一連の研究によって、SELEX技術をべースとした天然アプタマーの探索システムの確立が達成された。

In the current and previous years, the optimization method was discussed, and the method for preparing RNA from cultured cells, the method for increasing the amplification efficiency of PCR by selecting the terminal of RNA, the method for reducing the amplification efficiency of PCR by locking the length of RNA (HANDS method), and the method for exploring the natural amplification efficiency by SELEX were carried out. HEXIM1 and U1A are known to interact with the target protein, and HEXIM1 and U1A are known to interact with the target protein, and HEXIM 1 and U1A are known to interact with the target protein. In the early stages of culture, cells (HeLa cells) were isolated from whole RNA. Two kinds of methods for selecting target, including pre-selection, post-selection and post-selection are discussed. Select the carrier and the affinity carrier. Select the carrier and the interaction. All conditions are selected, the results are obtained, the results are selected, the results are added, the HEXIM1 interaction is obtained, the 7SK snRNA interaction is obtained, and the U1A interaction is obtained. The method of selecting the first line of the party and the column is: 7SK snRNA is obtained from the first line. The U1 snRNA was mostly obtained from the virus, and the whole virus was damaged. The result of this is that it is possible to obtain natural resources by means of a method of allocation and allocation. In the past year, a series of research and development projects have been carried out, and the research and development projects of SELEX technology have been established.