DNA転写時のRNAポリメラーゼ分子の動きの高感度リアルタイム計測

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本研究の目的は,転写中のRNAポリメラーゼ(以下RNAP)自身の動きを直接観察することにより,DNAの2重らせんに沿ったRNAPの回転運動を詳細に観察することにある。そのためには,ねじれ方向に柔らかいDNAをしっかりと固定し,観察に適したDNAを作製し,転写活性を保持した可視化の目印付きRNAPを作製する必要がある。本年度は,計画に基づき,主に実験材料の作製を行った。DNAの固定は,DNAの両端に化学修飾を施し,一端をガラスに,もう一端を磁気ビーズに結合させ,磁気ビーズを磁石で引っ張ることで行った。顕微鏡を用いて磁気ビーズのブラウン運動の減少を観察し,DNAが固定出来たことを確認した。転写過程を観察するためには,鋳型DNAに,適したプロモーター配列を挿入する必要がある。実験にはT7ファージ由来のRNAPを使うため,φ10T7プロモーター配列を1っ持ち,適当な長さの転写領域を持つDNAを作製した。それを材料に,PCR法を用いて観察用のDNAを増幅した。PCR時に用いるプライマーに修飾を加えておくことで,両端が化学修飾されたDNAを得た。転写領域の長さや配列を変えたもの,ガラス面からプロモーター配列までの距離を変えたものを実験目的に合わせて数種類作製した。RNAPの可視化には,機能に影響を与えないと思われる領域に,目印として蛍光ビーズや蛍光標識アクチンフィラメントを付けることにした。RNAPのN末に,ビオチン化酵素が認識するAviTag配列を組み込み,大腸菌を用いて発現,精製を行った。さらにin Vitroで,ビオチン化酵素を用いて,RNAPをビオチン化した。作製したラベル入りDNAと作製したビオチン化RNAPを用いて,活性測定を行い,両者ともに活性を保持していることを確認した。