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DNA転写時のRNAポリメラーゼ分子の動きの高感度リアルタイム計測

高灵敏度实时测量 DNA 转录过程中 RNA 聚合酶分子的运动

基本信息

批准号：
19770140
负责人：
加藤悠子
金额：
$ 2.36万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19770140/
关键词：
一分子計測 T7 RNAポリメラーゼ転写 DNA

项目摘要

本研究の目的は,転写中のRNAポリメラーゼ(以下RNAP)自身の動きを直接観察することにより,DNAの2重らせんに沿ったRNAPの回転運動を詳細に観察することにある。そのためには,ねじれ方向に柔らかいDNAをしっかりと固定し,観察に適したDNAを作製し,転写活性を保持した可視化の目印付きRNAPを作製する必要がある。本年度は,計画に基づき,主に実験材料の作製を行った。DNAの固定は,DNAの両端に化学修飾を施し,一端をガラスに,もう一端を磁気ビーズに結合させ,磁気ビーズを磁石で引っ張ることで行った。顕微鏡を用いて磁気ビーズのブラウン運動の減少を観察し,DNAが固定出来たことを確認した。転写過程を観察するためには,鋳型DNAに,適したプロモーター配列を挿入する必要がある。実験にはT7ファージ由来のRNAPを使うため,φ10T7プロモーター配列を1っ持ち,適当な長さの転写領域を持つDNAを作製した。それを材料に,PCR法を用いて観察用のDNAを増幅した。PCR時に用いるプライマーに修飾を加えておくことで,両端が化学修飾されたDNAを得た。転写領域の長さや配列を変えたもの,ガラス面からプロモーター配列までの距離を変えたものを実験目的に合わせて数種類作製した。RNAPの可視化には,機能に影響を与えないと思われる領域に,目印として蛍光ビーズや蛍光標識アクチンフィラメントを付けることにした。RNAPのN末に,ビオチン化酵素が認識するAviTag配列を組み込み,大腸菌を用いて発現,精製を行った。さらにin Vitroで,ビオチン化酵素を用いて,RNAPをビオチン化した。作製したラベル入りDNAと作製したビオチン化RNAPを用いて,活性測定を行い,両者ともに活性を保持していることを確認した。

The purpose of this study is to directly monitor the RNA activity in writing (the following RNAP), and to monitor the activity of the RNAP in the following two times. The direction is flexible, the DNA is fixed, the DNA is fixed, the writing activity is maintained, the RNAP is printed, and the necessary ones are printed. In this year's project, we plan to use the basic information, and the main materials will be used as the basis for the project. The DNA is fixed, the chemical repair is applied at the end of the DNA, one end is fixed, the other end is connected with the magnet, and the magnet is introduced. The micrometer uses the magnetic device to make sure that the DNA is fixed to confirm that the device is not fully monitored. During the process of writing, please check that you need to know how to use DNA, and that you need to enter the necessary information. The reason for this is that the RNAP system makes it possible for the φ 10T7 system to be equipped with the following equipment: 1%, and when the chief executive holds the DNA in the field of writing, you will be responsible for it. The PCR method is used to observe the width of the material. The DNA method is used. In PCR, you can use the chemical repair device to improve the DNA performance. In the field of writing, there is a wide range of information systems, and the number of users is in line with the number of users in the field. The RNAP system can be customized, and the computer can be used in the field of thinking, and the information can be printed in the field of information. At the end of the RNAP, the enzyme enzyme assay was used to identify the AviTag, and the bacteria were detected by the enzyme assay. In Vitro, RNAP, enzyme, enzyme. Make sure that the RNAP is used in the DNA, the activity is determined, and the activity is maintained.