ヒストン修飾酵素の活性を検出する新規蛍光プローブの開発

开发一种新的荧光探针来检测组蛋白修饰酶的活性

• 批准号: 14J00565
• 负责人: 馬場 玲輔
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J00565/
• 关键词: ヒストン脱アセチル化酵素; 発蛍光プローブ; ペプチド; エピジェネティクス

本研究では、ワンステップの簡便な操作でHDAC活性を蛍光検出できるプローブの開発に取り組んできた。HDACによる基質リジンの脱アセチル化により、求核性のアミノ基が生成する点に着目し、プローブK4(Ac)-CCBをデザインした。K4(Ac)-CCBは、HDACの天然基質であるヒストン由来ペプチドと、蛍光色素であるクマリン誘導体から構成されている。ペプチドには、酵素反応部位としてN末端から4番目にアセチルリジンを導入した。また、活性検出の蛍光スイッチとしてクマリンの7位のヒドロキシル基を炭酸エステル化し、酵素反応前のプローブの蛍光を消光させた。プローブの酵素活性検出原理は次の通りである。まず、K4(Ac)-CCBがHDACにより脱アセチル化されるとK4側鎖に求核性アミノ基が生成し、分子内で炭酸エステルに求核攻撃する。これにより、クマリンからアミンへエステル転移反応が進行し、消光していたクマリン誘導体の蛍光が回復すると考えた。合成したプローブにHDACを添加すると、酵素反応に続き、期待通り転移反応が進行し蛍光強度の上昇が確認された。これにより、HDAC活性を混ぜるだけのワンステップの操作で検出することが世界で初めて可能となった。続いて、上記の分子内転移反応を用いた発蛍光スイッチの汎用性を検証するために、プローブに導入するペプチド配列長を変えた、40種類のプローブライブラリを作製した。合成したプローブすべてにおいて転移反応の進行が確認され、HDAC活性を蛍光検出することができた。さらに、検出速度の大幅な向上も達成した。以上より、分子内エステル転移反応が汎用的な発蛍光スイッチであることを証明し、ヒストン修飾酵素の活性を従来法よりも極めて簡便に検出できるツールの開発に成功したと言える。

In this study, HDAC activity was detected by light microscopy, and the development of HDAC was studied. HDAC matrix separation and depolarization, nuclear separation and depolarization are the key points of HDAC matrix separation and depolarization, and HDAC matrix separation and depolarization are the key points of HDAC matrix separation and depolarization. K4 (Ac)-CCB and HDAC are composed of natural matrix, fluorescent pigment and inducer. The N-terminal part of the enzyme is introduced into the cell. 7-position of the active matrix is activated by carbon, and the active matrix is activated by carbon. The principle of enzyme activity detection is the same as that of other enzymes. K4 (Ac)-CCB is a highly selective inhibitor of HDAC. It can be used to detect the nuclear activity of K4-CCB and to detect the nuclear activity of K4-CCB. This is the first time I've ever seen a woman who's been in a coma. The synthesis of HDAC is confirmed by the addition of enzymes and the expected increase in light intensity. This is the first time in the world that HDAC activity has been mixed. In addition, the molecular shift reaction of the above two types of molecules can be controlled by the following methods: The process of synthesis and purification of HDAC was investigated. The speed of detection and detection is greatly increased. The above proves that the ubiquitous use of intramolecular Essex migration reactions can be used to detect the activity of Essex modifying enzymes. This method is extremely simple and easy to detect, and the development of Essex has been successful.

项目成果

Redesign of Fluorogenic Probes for Detection of Histone Deacetylase Activity

重新设计用于检测组蛋白脱乙酰酶活性的荧光探针

• 发表时间: 2014
• 作者: Reisuke BABA;Yuichiro HORI;Kazuya KIKUCHI
• 通讯作者: Kazuya KIKUCHI