遷移金属錯体を活用した標品不要のタンパク質・ペプチド絶対定量基盤の構築

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遷移金属錯体を配したエドマン型試薬による高感度・高選択的タンパク質絶対定量法の構築を目的に、試薬デザインと調製、及びモデルペプチドへの適用と分析を行った。まず、鍵化合物であるメタロセン型エドマン試薬を調製した。即ち、フェロセニルイソチオシアネート (FcITC) 及びフェロセニルエチルイソチオシアネート (FcEtITC) を、対応するアミンからチオ炭酸O,O'-ジ-2-ピリジルとの一段階反応で調製した。次いで、これらとモデルペプチド (アンジオテンシンII) の反応を精査した所、常法 (アルカリ性溶媒、55℃加熱) によるエドマン試薬付加条件で各々98%, 87%の高収率なラベル化を認めた。ちなみに、過剰試薬はn-ヘキシルアミンでクエンチ後、n-ヘキサンを用いた液-液抽出で除去した。試薬付加アンジオテンシンIIの分析を液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析 (LC/MS/MS) で行うため、エレクトロスプレーイオン化を試料分離・検出感度の観点から精査した。その結果、分離カラムに汎用型ODSカラム、移動相にペプチドの分離・イオン化に好適なギ酸/水/アセトニトリル系溶媒を用いる時、高感度な検出が可能であった。また、LC/MS/MSにより、ラベル化部位は、ペプチドN末端アミノ基である事が判明した。この時、試薬付加アンジオテンシンIIからは、ペプチド同定の際に有用なb及びyイオン系列のフラグメントが主に得られた。以上、メタロセン型エドマン試薬によるペプチドのラベル化・分析時のフラグメント特性が明らかとなり、本法をタンパク質絶対定量に適用するための基礎的検討がなされた。