テルペンおよび前駆体合成酵素の活性進化

テルペンは香料、医薬品、農薬などとして広く利用される天然化合物群である。近年、有価テルペンを微生物に大量生産させる試みが盛んである。テルペンの前駆体であるプレニルニリン酸の供給を増やすと、テルペン生産性は向上する。大腸菌に構築されたテルペン合成経路は、ユビキノンやC55PPといった細胞増殖に必須のリソースの合成と、プレニルニリン酸消費において競合している。ゲラニオール合成酵素変異体 (GESM53) は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害 (コロニー形成の阻害) を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路 (MEP経路) の改良を試みた。MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ，GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100％回復させた。一方，MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。

テルペンは香料、医薬品、農薬などとして広く利用される天然化合物群である。近年、有価テルペンを微生物に大量生産させる試みが盛んである。テルペンの前駆体であるプレニルニリン酸の供給を増やすと、テルペン生産性は向上する。大腸菌に構築されたテルペン合成経路は、ユビキノンやC55PPといった細胞増殖に必須のリソースの合成と、プレニルニリン酸消費において競合している。ゲラニオール合成酵素変異体 (GESM53) は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害 (コロニー形成の阻害) を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路 (MEP経路) の改良を試みた。MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ，GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100％回復させた。一方，MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。