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テルペンおよび前駆体合成酵素の活性進化

萜烯和前体合酶的活性进化

基本信息

批准号：
14J08173
负责人：
岩嵜美希
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

テルペンは香料、医薬品、農薬などとして広く利用される天然化合物群である。近年、有価テルペンを微生物に大量生産させる試みが盛んである。テルペンの前駆体であるプレニルニリン酸の供給を増やすと、テルペン生産性は向上する。大腸菌に構築されたテルペン合成経路は、ユビキノンやC55PPといった細胞増殖に必須のリソースの合成と、プレニルニリン酸消費において競合している。ゲラニオール合成酵素変異体 (GESM53) は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害 (コロニー形成の阻害) を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路 (MEP経路) の改良を試みた。MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ，GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100％回復させた。一方，MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。

Natural compounds are used in spices, pharmaceuticals, and agricultural products. In recent years, there have been a lot of microbial production. The precursor of the process is to increase the productivity of the process. E. coli constructs a synthetic pathway for C55PP, which is essential for cell proliferation. GESM53 is a novel enzyme that inhibits cell proliferation due to high GPP consumption activity and deficiency of C55PP. By taking advantage of this phenomenon, GPP productivity can be improved and genetic types can be "selected with or without cell proliferation". This year, we tried to improve the MEP pathway by using this method. The MEP pathway is composed of enzymes and enzymes, and the GESM53 regulates the degree of cell proliferation inhibition and recovery. Idi farnesyl diphosphate synthase (FPPS) is an additional discovery and growth rate that increases by 100%. On the one hand, MEP circuit final temperature drop is responsible for IPH over-development and bacterial recovery. This is the first time I've ever seen a woman. About 5000 clones of IspH-variant GES have been found, and 11 clones of IspH-variant GES have been found Select the IspH-variant from the synthetic pathway to the E. coli pathway, FPP from the synthetic pathway to the synthetic pathway to adjust the IspH-variant from the wild-type to the productive pathway to the CxPP pathway. In the future, we'll get a lot of information about productivity.