進化工学を用いた人工DNAゲノム機能発現の最適化

利用进化工程优化人工DNA基因组功能表达

• 批准号: 22KJ0540
• 负责人: 古林 太郎
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0540/
• 关键词: 進化工学; 指向性進化; 実験進化; 人工細胞; DNA複製; 無細胞翻訳; 分子進化; 無細胞翻訳系; タンパク質工学

2022年度は、前年度に最適化したphi29複製系を進化に必須となる微小区画(w/oエマルション)系に持ち込むための検討を行った。申請時は野地研の独自技術である微小リアクタデバイスを用いる予定であったが、ホモジェナイザーを用いてエマルションを生成する方法が本研究で用いる自己複製系との相性がよく、進化サイクルを複数ラウンドにわたって高速に回せる、より大きなライブラリーサイズを確保できる、微小液滴サイズを非常に小さくできるなどの性質の良さを重視してこの手法を選択した。phi29複製反応がうまく動作するようなエマルションの作成法を検討し、複製が高効率で動作するような生化学的条件を同定した。次に、このエマルションが微小区画として重要な2つの機能を果たせるかどうかを検討した。1つ目は「微小空間による1分子の濃縮効果」である。進化にあたっては1区画あたり1コピーのDNAから自己複製反応を行う必要があるが、DNA濃度が低すぎると翻訳されたタンパク質とDNAが出会えず、複製が起こらないことが知られている。私はDNAをpM以下の濃度にした複製反応をバルク・区画化条件で比較し、区画化条件でのみ複製が起こることから、区画が確かに微小反応場として動作していることを確認した。2つ目は、「機能性DNAの選択的増幅」である。進化実験の入力として与えられる変異体ライブラリ中のDNAは多くが遺伝子機能の壊れた配列であり、野生型より高機能な配列はごく稀である。したがって、微小区画によってDNA集団を確実に1コピーずつ隔離し、遺伝子機能を向上させたDNAだけを効率よく選択する必要がある。私は複製起点Oriをもつ自己複製DNA(DNAポリメラーゼをコード)と、蛍光タンパク(複製に関係ない疑似遺伝子)をコードしたDNA集団を混合して区画内複製反応を行い、確かに自己複製DNAだけが選択的に増幅されることを確かめた。

Before 2022 annual は, annual に optimization し た phi29 replication system を に evolution must と な る tiny area drawing (w/o エ マ ル シ ョ ン) department に hold ち 込 む た め の 検 line for を っ た. Application は field research の technology alone で あ る tiny リ ア ク タ デ バ イ ス を with い る designated で あ っ た が, ホ モ ジ ェ ナ イ ザ ー を with い て エ マ ル シ ョ ン を generated す る method が で this study use い る yourself copying と の photograph sex が よ く, evolution サ イ ク ル を plural ラ ウ ン ド に わ た っ て high-speed に back せ る, よ り big き な ラ イ ブ ラ リ ー サ イ ズ を ensure で き る, tiny droplets サ イ ズ を very small に さ く で き る な ど の nature good の さ を attaches great importance to the し て こ の gimmick を sentaku し た. Phi29 copy the 応 が う ま く action す る よ う な エ マ ル シ ョ ン の consummate method を beg し 検 で action, high copy が sharper rate す る よ う な biochemistry conditions を be し た. に, こ の エ マ ル シ ョ ン が tiny area painting と し て important な 2 つ の function を fruit た せ る か ど う か を beg し 検 た. 1 による objective "microspace による1 molecule <s:1> concentration effect" である. Evolutionary に あ た っ て は district 1 draw あ た り 1 コ ピ ー の DNA か ら themselves copying the 応 を line う necessary が あ る が, low concentration of DNA が す ぎ る と turn 訳 さ れ た タ ン パ ク qualitative と DNA が will え ず, copy が こ ら な い こ と が know ら れ て い る. Private は を pM the following の DNA concentration に し た copy the 応 を バ ル ク area, draw the condition し, area are compared で で の み copy が up こ る こ と か ら, area painting が か indeed に small game against 応 と し て action し て い る こ と を confirm し た. 2 択 objective, "the increase in functional DNA selective 択" である. Evolution be 験 の と into force し て and え ら れ る - variant ラ イ ブ ラ リ の DNA は more く が heritage 伝 sub function の 壊 れ た match column で あ り, wild type よ り high functional な match column は ご く dilute で あ る. し た が っ て, small area に よ っ て DNA set 団 を indeed be に 1 コ ピ ー ず つ isolation し upward, but 伝 function を さ せ た だ DNA け を sharper rate よ く sentaku す る necessary が あ る. Private は copy starting point Ori を も つ own replication of DNA (DNA ポ リ メ ラ ー ゼ を コ ー ド) と 蛍 light タ ン パ ク (copy に masato is な い suspected heritage 伝) を コ ー ド し た DNA set 団 を mixed し て area within the painting copy the 応 を い, indeed か に their DNA replication だ け が sentaku に raised of さ れ る こ と を か indeed め た.

项目成果

An <i>in vitro</i> Evolutionary Journey of an Artificial RNA Replication System Towards Biological Complexity

人工 RNA 复制系统走向生物复杂性的<i>体外</i>进化之旅

• DOI: 10.2142/biophys.61.240
• 发表时间: 2021
• 期刊: Seibutsu Butsuri
• 作者: FURUBAYASHI Taro;ICHIHASHI Norikazu
• 通讯作者: ICHIHASHI Norikazu

phi29 ファージ DNA 複製を用いた人工 DNA ゲノム進化系の構築

phi29 利用噬菌体DNA复制构建人工DNA基因组进化系统

• 发表时间: 2022
• 作者: 天野亮;道下 瑛陽;中野 涼太,一ノ瀬顕子;浜田道昭;中村義一;高橋理貴;古林太郎
• 通讯作者: 古林太郎