新規Ｄｒｅａｍｌｅｓｓ遺伝子に基づくレム睡眠制御機構の解明

＜平成27年度研究実施状況＞レム睡眠の異常をもたらす新規遺伝子Dreamless、CRISPR/Casシステムを用いた変異の再現目的と方法）本研究の開始より以前、すでにDreamless変異マウスにおける候補遺伝子および塩基配列変異部位が染色体連鎖解析と次世代シークエンシングにより同定されていた。通常、フォワードジェネティクス研究で候補遺伝子が見出され、その表現型が優性遺伝だった場合、同様の遺伝子変異を導入したマウスを作製し、同じ表現型を示すかどうかを確認することで、原因遺伝子かどうかを確定することができる。また今回は、化学変異原ENUで遺伝子変異がランダムかつ複数導入されているため、同一染色体内の他の遺伝子にも変異が残存している可能性が残されていた。そこで、CRISPR/Casシステムを用いて候補遺伝子のみに特異的に変異導入することでDreamless変異マウスを再現し、Dreamless遺伝子変異と表現型の因果関係を確定する実験を計画した。すなわち、本研究におけるDreamless家系と同様のレム睡眠異常が認められるかどうかを、個体レベルで最新のゲノム編集技術により迅速に検討することを試みた。結果）Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子の証明Cas9タンパクとガイドRNAをコードするプラスミドベクターおよび変異導入の鋳型となる一本鎖DNAをマウス胚に同時微小注入することで、Dreamless特異的遺伝子改変アリルを持つマウス個体の作成に成功し、この変異アリルが遺伝性を有することも確認した。このヘテロ変異個体を用いて、脳波筋電図測定（EEG/EMG recording）により睡眠覚醒行動様式について解析した結果、ENU由来のDreamless変異マウスと同じレム睡眠時間減少の表現型を示すことがわかった。すなわち、Dreamless遺伝子がレム睡眠異常の原因遺伝子であることを直接証明し、本研究におけるレム睡眠異常と原因遺伝子変異部位との因果関係を確定することができた。

＜平成27年度研究実施状況＞レム睡眠の異常をもたらす新規遺伝子Dreamless、CRISPR/Casシステムを用いた変異の再現目的と方法）本研究の開始より以前、すでにDreamless変異マウスにおける候補遺伝子および塩基配列変異部位が染色体連鎖解析と次世代シークエンシングにより同定されていた。通常、フォワードジェネティクス研究で候補遺伝子が見出され、その表現型が優性遺伝だった場合、同様の遺伝子変異を導入したマウスを作製し、同じ表現型を示すかどうかを確認することで、原因遺伝子かどうかを確定することができる。また今回は、化学変異原ENUで遺伝子変異がランダムかつ複数導入されているため、同一染色体内の他の遺伝子にも変異が残存している可能性が残されていた。そこで、CRISPR/Casシステムを用いて候補遺伝子のみに特異的に変異導入することでDreamless変異マウスを再現し、Dreamless遺伝子変異と表現型の因果関係を確定する実験を計画した。すなわち、本研究におけるDreamless家系と同様のレム睡眠異常が認められるかどうかを、個体レベルで最新のゲノム編集技術により迅速に検討することを試みた。結果）Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子の証明Cas9タンパクとガイドRNAをコードするプラスミドベクターおよび変異導入の鋳型となる一本鎖DNAをマウス胚に同時微小注入することで、Dreamless特異的遺伝子改変アリルを持つマウス個体の作成に成功し、この変異アリルが遺伝性を有することも確認した。このヘテロ変異個体を用いて、脳波筋電図測定（EEG/EMG recording）により睡眠覚醒行動様式について解析した結果、ENU由来のDreamless変異マウスと同じレム睡眠時間減少の表現型を示すことがわかった。すなわち、Dreamless遺伝子がレム睡眠異常の原因遺伝子であることを直接証明し、本研究におけるレム睡眠異常と原因遺伝子変異部位との因果関係を確定することができた。