新規核酸医薬基盤技術への展開を志向したＲＮＡ化学修飾反応の開発とその機能評価

RNA化学修饰反应的开发和功能评价旨在开发新的核酸医学基础技术

• 批准号: 15J03430
• 负责人: 實崎 大地
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J03430/
• 关键词: 核酸化学; RNA化学修飾; 遺伝情報編集; 核酸医薬品; RNA; 人工核酸

本研究では、研究代表者がこれまでに開発したRNAの部位特異的修飾法(官能基転移反応)を基盤として、アンチセンス法やsiRNAとは異なる新たな核酸医薬研究のアプローチとしてmRNAの部位特異的化学修飾によるコドン情報を変化させる(遺伝情報編集技術)技術の確立を目的とした。官能基転移反応によるmRNAを標的とした部位特異的修飾および修飾mRNAが翻訳過程に与える影響を明らかとする手法の確立を目指し、人工mRNAを用いた評価系の構築を検討した。本検討では、人工mRNAの3'側下流領域に存在する標的シトシン部位に対して官能基転移反応、引き続くin vitro translation行い、得られたタンパク質に対し、His-Tag精製、enterokinaseによる処理を行うことで、標的シトシン部位を含むコドンから翻訳された部位を含む短鎖ペプチドを単離しMALDI-TOFMSで検出することに成功した。しかしながら、コード改変による変異を検出することは達成できなかった。この理由として、長鎖RNAに対する官能基転移反応が進行していなかった可能性が考えられたため、RNase Hおよびchimera probeを用いた官能基修飾mRNAの検出・定量法の開発を続いて行うこととした。この手法では、官能基転移反応標的RNA領域の3'および5'側配列に対して2'-OMe/DNAプローブとRNase Hを反応させ、RNAを選択的に切断し、得られた官能基修飾RNA断片をPAGE分析することでバンドシフトより修飾RNAの検出・定量を期待した。現在、本手法でのRNA選択的切断と検出は達成されており、今後は官能基修飾RNA断片の検出・定量を目指す。また、長鎖RNAに対する官能基転移反応による化学修飾の検出・定量が達成された後、前述した人工mRNAの評価系でコドン改変の評価を行う予定である。

This study aims to develop site-specific modifications of RNA (functional group shift), establish a new technology for siRNA-based, siRNA-based, and siRNA-based approaches to nucleic acid medicine research, and establish a new technology for site-specific chemical modifications of mRNA (gene information compilation technology). Functional base shift mRNA target site-specific modification and modification mRNA translation process and the establishment of methods to guide the use of artificial mRNA evaluation system The present study is aimed at detecting the presence of target gene sites in the 3'downstream domain of artificial mRNA, including functional group shift, introduction in vitro translation, quality control, His-Tag refinement, enterokinase processing, and short-lock selection in MALDI-TOFMS. The difference between the two is that The reason for this is that the functional group shift reaction is carried out in the presence of RNase H and chimera probes. This approach is aimed at the 3'and 5' side alignment of RNA domains with functional group shift targets, and the detection and quantification of modified RNA fragments by PAGE analysis of RNA fragments selected for cleavage of RNA fragments with 2'-OMe/DNA primers and RNase H. Now, the detection of RNA fragments selected by this method is completed, and the detection and quantification of functional group modified RNA fragments are indicated in the future. After the detection and quantification of chemical modifications in the functional group shift reaction of long-locked RNA was achieved, the evaluation of the artificial mRNA system described above was determined.

项目成果

塩基・部位特異的RNA化学修飾能を持つ官能基転移核酸による遺伝情報制御法の開発

利用具有碱基/位点特异性RNA化学修饰能力的功能基团转移核酸开发遗传信息控制方法

• 发表时间: 2016
• 作者: Nobuhiro Fujimaki;Takashi Miura;Takakazu Nakabayashi;藤巻暢宏，三浦隆史，中林孝和;Oshiro I. Jitsuzaki D. Onizuka K. Nishimoto A. Taniguchi Y. and Sasaki S;大城郁也
• 通讯作者: 大城郁也

Site-specific modification of the 6-amino group ofadenosine in RNA by an inter-strand functionality-transfer reaction using an S-functionalized-4-thiothymidine

使用 S-功能化-4-硫胸苷通过链间功能转移反应对 RNA 中腺苷的 6-氨基进行位点特异性修饰

• DOI: 10.1002/cbic.201500084
• 发表时间: 2015
• 期刊: ChemBioChem,
• 作者: Nobuhiro Fujimaki;Takashi Miura;Takakazu Nakabayashi;藤巻暢宏，三浦隆史，中林孝和;Oshiro I. Jitsuzaki D. Onizuka K. Nishimoto A. Taniguchi Y. and Sasaki S
• 通讯作者: Oshiro I. Jitsuzaki D. Onizuka K. Nishimoto A. Taniguchi Y. and Sasaki S

金属応答性ピリミジン型機能性核酸を用いたアデニン選択的RNA修飾法の開発

开发使用金属响应嘧啶型功能核酸的腺嘌呤选择性RNA修饰方法

• 发表时间: 2015
• 作者: Nobuhiro Fujimaki;Takashi Miura;Takakazu Nakabayashi;藤巻暢宏，三浦隆史，中林孝和;Oshiro I. Jitsuzaki D. Onizuka K. Nishimoto A. Taniguchi Y. and Sasaki S;大城郁也;大城郁也
• 通讯作者: 大城郁也