アデニレーションドメインに対するテーラーメイドケミカルラベリング法の開発

开发腺苷酸化结构域的定制化学标记方法

• 批准号: 15J06198
• 负责人: 今野 翔
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J06198/
• 关键词: 非リボソーム性ペプチド合成酵素; アデニレーションドメイン; 合成分子プローブ; プロテオミクス; ケミカルラベリング

平成27年度は、アデニレーション（A）ドメインに対する合成分子プローブを基盤として、ペプチド性抗生物質であるグラミシジンS生産菌のプロテオーム中に存在する内在性GrsA及びGrsBのラベル化・検出法の確立を図った。まず、精製タンパク質においてラベル化されることが確認されているL-Pheに基質特異性を有するGrsAについて、グラミシジンS生産菌であるAneurinibacillus migulanus株のプロテオーム中に存在する内在性GrsAのラベル化・検出を試みた。L-Pheをリガンド部に有するL-Phe-AMS-BPyneを用いて種々条件を検討した結果、GrsAの分子量に相当する120 kDaの位置に特異的にラベル化されるバンドが確認された。そこで、このタンパク質が内在性GrsAであるか確認するため、タグ分子をビオチンに変換し、タンパク質の精製及び同定を試みたところ、内在性GrsAであることが明らかになった。次に、一つのタンパク質上に4つのAドメインが存在するGrsBに対するラベル化実験を行うことにした。GrsBは4つのモジュールからなる約500 kDaの巨大NRPSであり、そのAドメインはそれぞれ L-Pro、L-Val、L-Orn、L-Leuを基質とする。そこで、リガンド部にL-Pro、L-Val、L-Orn、L-Leu を有する4種類のプローブ及び阻害剤をそれぞれ合成し、A. migulanusのプロテオームに処理した。その結果、全てのプローブにおいて内在性GrsBの選択的ラベル化が確認された。また、プローブと阻害剤を組み合わせた競合実験から、それぞれのプローブはリガンド部のアミノ酸依存的にGrsB上の対応した基質特異性を有するAドメインを特異的にラベル化していることが明らかになった。

Heisei 27, は, アデニレーション (A) ドメインに対する synthetic molecule プローブを base plate として, ペプチドantibiotic substance であThe existence of GrsA and GrsB in the るグラミシジンS production bacteria, のプロテオーム中に, and the establishment of the 検出法を図った.まず, purified タンパクquality においてラベル化されることがconfirmed されているL-Pheに matrix specificityを有するGrsAについて、グラミシジンS producing bacteria であるAneurinibacillus migulanus strain のプロテオーム中に EXISTENCE する internal nature GrsA のラベル化・検出をtrial みた. L-Phe ををリガンド部に有するL-Phe-AMS-BPyneをいてkind々conditionsを検した results, GrsA molecular weight is equivalent する120 kDa position specific kDa にベル化されるバンドがconfirmationされた.そこで、このタンパク性が内性 GrsAであるかConfirmationするため、タグmoleculeをビオチンに変changeし, タンパク性の精和び同定を trial みたところ, intrinsic GrsA であることが明らかになった. The second time, the quality of the 4 つのA ドメインが existence するGrsB に対するラベル化実験を行 うことにした. GrsBは4つのモジュールからなるAbout 500 kDaのHUGENRPSであり、そのAドメインはそれぞれL-Pro, L-Val, L-Orn, L-Leu are the base materials.そこで、リガンド部にL-Pro、L-Val、L-Orn、L-Leu を有する4 kinds of のプローブ and び hindering をそれぞれ synthetic し, A. migulanus のプロテオームにtreatment した.そのRESULTS、All てのプローブにおいてinternality GrsBの选択's ラベル化がconfirmationされた. It's a good match , それぞれのプローブはリガンド部のアミノ acid-dependent The matrix specificity of the GrsB is the specific matrix specificity of the GrsB.

项目成果

アデニレーションドメインに対する活性部位指向型プローブを用いた非リボソーム性ペプチド合成酵素活性のプロファイリング

使用腺苷酸化结构域的活性定点探针分析非核糖体肽合成酶活性

• 发表时间: 2015
• 作者: 今野翔;石川文洋;鈴木健裕;堂前直;掛谷秀昭
• 通讯作者: 掛谷秀昭

Profiling Nonribosomal Peptide Synthetase Activities Using Chemical Proteomic Probes for Adenylation Domains

• DOI: 10.1021/acschembio.5b00097
• 发表时间: 2015-09-01
• 期刊: ACS CHEMICAL BIOLOGY
• 影响因子: 4
• 作者: Ishikawa, Fumihiro;Konno, Sho;Kakeya, Hideaki
• 通讯作者: Kakeya, Hideaki

Functional profiling of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases by competitive activity-based protein profiling

• DOI: 10.1039/c5cc04953a
• 发表时间: 2015-01-01
• 期刊: CHEMICAL COMMUNICATIONS
• 影响因子: 4.9
• 作者: Kasai, Shota;Konno, Sho;Kakeya, Hideaki
• 通讯作者: Kakeya, Hideaki

Profiling of nonribosomal peptide synthetase activities using active site-directed proteomic probes for adenylation domains

使用腺苷酸化结构域的活性定点蛋白质组探针分析非核糖体肽合成酶活性

• 发表时间: 2015
• 作者: Sho Konno;Fumihiro Ishikawa;Takehiro Suzuki;Naoshi Dohmae;Hideaki Kakeya
• 通讯作者: Hideaki Kakeya

活性部位指向型プローブを利用したアデニレーションドメインの機能プロファイリング

使用活性定点探针对腺苷酸化结构域进行功能分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 今野翔;笠井昭太;石川文洋;掛谷秀昭
• 通讯作者: 掛谷秀昭